呂春榮，李衛(wèi)娟，權(quán)國(guó)波，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞微生物污染檢測(cè)

呂春榮，李衛(wèi)娟，權(quán)國(guó)波，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

為檢測(cè)云南半細(xì)毛羊毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cells，HFSCs）是否受到微生物污染，為后續(xù)的誘導(dǎo)分化等研究奠定基礎(chǔ)。用培養(yǎng)法檢測(cè)細(xì)菌、真菌污染；利用熒光染色劑Hoechst33342檢測(cè)支原體污染。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞和陰性對(duì)照中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染，實(shí)驗(yàn)組中有25%的細(xì)胞受到霉菌污染；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，僅細(xì)胞核顯色，細(xì)胞表面及細(xì)胞周?chē)蓛?、清晰，無(wú)熒光小點(diǎn)。說(shuō)明云南半細(xì)毛羊HFSCs沒(méi)有細(xì)菌、支原體污染，僅有25%細(xì)胞受到霉菌污染。霉菌孢子對(duì)環(huán)境的耐受力很強(qiáng)，普通的消毒液很難清除，所以對(duì)操作環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重危害。

云南半細(xì)毛羊；HFSCs；污染

污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中長(zhǎng)期面臨的問(wèn)題。物理、化學(xué)及生物因素都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境對(duì)細(xì)胞造成污染。造成動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系污染的主要微生物是細(xì)菌、真菌、支原體等。入侵的微生物在培養(yǎng)體系中不斷增殖、代謝。微生物代謝消耗大量必需的養(yǎng)分，同時(shí)產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用［1］。

培養(yǎng)細(xì)胞作為一個(gè)生物體，會(huì)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物做出相應(yīng)的反應(yīng)，造成培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性改變，而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成潛在威脅，并隨著污染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，使研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性大大下降。American Type Culture Collection（ATCC）和日本理化研究所制訂了標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞系的細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染的檢測(cè)條例。中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)也把對(duì)支原體污染的檢測(cè)作為最基本的質(zhì)量控制。因此，對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行微生物污染檢測(cè)尤為重要。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室所分離培養(yǎng)的云南半細(xì)毛羊HFSCs進(jìn)行微生物污染檢測(cè)，為以后有關(guān)云南半細(xì)毛羊HFSCs進(jìn)一步的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛囊干細(xì)胞

來(lái)自于云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草食家畜研究所2012年冷凍保存的不同代次的云南半細(xì)毛羊HFSCs 16支（第二代至第九代各2支為實(shí)驗(yàn)組）；細(xì)菌、真菌陰性對(duì)照：DMEM／F12培養(yǎng)基各2支；細(xì)菌、真菌陽(yáng)性對(duì)照：將枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到DMEM／F12培養(yǎng)基；支原體陽(yáng)性對(duì)照：選取典型的支原體污染檢測(cè)照片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌、真菌檢測(cè)

1）實(shí)驗(yàn)組：將復(fù)蘇后的HFSCs細(xì)胞懸液接種到DMEM／F12培養(yǎng)基中，置于37.5℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

2）陽(yáng)性對(duì)照組：將枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到DMEM／F12培養(yǎng)基中，置于37.5℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

3）陰性對(duì)照組：DMEM／F12培養(yǎng)基各2支，置于37.5℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

1.2.2 支原體檢測(cè)

1）陽(yáng)性對(duì)照：選取典型的支原體污染檢測(cè)照片作為陽(yáng)性對(duì)照。

2）實(shí)驗(yàn)組：將被檢HFSCs爬片在不含抗生素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～3 d后，吸去培養(yǎng)液，用PBS漂洗，冷風(fēng)吹干。用固定液固定細(xì)胞爬片15 min。然后將配制好的Hoechst33342工作染液滴加到固定好的細(xì)胞上，在室溫下染色，30 min后用PBS浸洗染色后的蓋玻片3次，每次3～5 min，冷風(fēng)吹干。最后將含1%甘油的PBS加到染色后的細(xì)胞表面，將有細(xì)胞的蓋玻片面朝下覆蓋在載玻片上。封片處理完畢后晾干，用熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞核周?chē)欠裼兴{(lán)色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)的熒光物產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌、真菌污染檢測(cè)結(jié)果

HFSCs的培養(yǎng)基和陰性對(duì)照一樣，沒(méi)有混濁，倒置顯微鏡高倍鏡下也沒(méi)有觀(guān)察到點(diǎn)狀的細(xì)菌；實(shí)驗(yàn)組中有4支細(xì)胞在96 h后在細(xì)胞瓶壁可以見(jiàn)到明顯的成片或是成塊狀的霉菌菌落，在倒置相差顯微鏡下能見(jiàn)到成樹(shù)枝狀生長(zhǎng)的菌絲，如圖1E所示。陽(yáng)性對(duì)照均有明顯微生物生長(zhǎng)，在倒置鏡下可見(jiàn)視野內(nèi)布滿(mǎn)點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來(lái)清晰的背景變得模糊，如圖1A所示。成樹(shù)枝狀的霉菌如圖1B所示。

2.2 支原體檢測(cè)結(jié)果

陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，僅細(xì)胞核顯色，細(xì)胞表面及細(xì)胞周?chē)蓛?、清晰，無(wú)熒光小點(diǎn)，如圖1F所示。陽(yáng)性對(duì)照組經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，可見(jiàn)細(xì)胞核與細(xì)胞膜及其周?chē)梢?jiàn)散在的藍(lán)色熒光顆粒，如圖1C所示。

圖1 微生物污染檢測(cè)

3 討論

3.1 真菌污染

霉菌孢子對(duì)環(huán)境的耐受力很強(qiáng)，普通消毒液很難清除，所以對(duì)操作環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重危害。37℃的培養(yǎng)溫度已經(jīng)超過(guò)霉菌最適生長(zhǎng)溫度（25℃左右），因而其生長(zhǎng)速度更慢，一般培養(yǎng)96 h時(shí)肉眼才能觀(guān)察到棉絮狀的菌絲團(tuán)等漂浮在培養(yǎng)液中［3］。霉菌污染后在低倍鏡下可見(jiàn)乳白色的團(tuán)狀漂浮物，培養(yǎng)液無(wú)變化；高倍鏡下可見(jiàn)明顯的菌絲，細(xì)胞活力變差，生長(zhǎng)速度明顯變慢，甚至死亡［4］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)16支云南半細(xì)毛羊HFSCs進(jìn)行真菌污染檢測(cè)，有25%的細(xì)胞受到霉菌污染。霉菌污染率偏高，污染細(xì)胞集中在第四、五代細(xì)胞。這主要是受實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境及今年6、7月份云南降雨量較大、環(huán)境潮濕易發(fā)生霉菌污染所致。

3.2 支原體污染

細(xì)胞培養(yǎng)體系造成污染的微生物主要是細(xì)菌、真菌、支原體等，細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是很普遍的問(wèn)題，做好支原體污染的防治工作，是保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的重要一環(huán)。支原體污染，對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎所有的指標(biāo)及產(chǎn)物均有影響，而且可以不被察覺(jué)地隨著細(xì)胞的傳代而傳代［5-9］。

支原體污染的來(lái)源包括：所使用動(dòng)物來(lái)源的一些產(chǎn)品如血清或已被支原體污染的細(xì)胞株系。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中支原體的濃度可達(dá)107個(gè)/mL，而培養(yǎng)的細(xì)胞看起來(lái)很正常，在肉眼觀(guān)察或普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，受污染的細(xì)胞可無(wú)明顯變化［2］。體外培養(yǎng)的細(xì)胞被支原體污染后，幾乎所有的指標(biāo)及產(chǎn)物均受其影響，故有效地檢測(cè)支原體污染是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵所在［10］。Chen［11］率先使用非特異性的DNA熒光染料Hoeehst33255，直接對(duì)可貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物作DNA熒光染色，檢測(cè)支原體污染，擴(kuò)大了可被檢出的支原體種類(lèi)，縮短和簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程。其原理為：染色劑能透過(guò)胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核DNA中，結(jié)合到DNAA-T富含區(qū)域。而支原體A-T含量較高（55%～80%），亦能著色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察可看到藍(lán)色熒光。因此，污染了支原體的細(xì)胞表面會(huì)有藍(lán)色點(diǎn)狀或絲狀熒光［12］。所以可將其染色、檢測(cè)。用熒光染色劑染色的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀(guān)察，無(wú)支原體污染的細(xì)胞只有細(xì)胞核顯色。而有支原體污染的細(xì)胞，在細(xì)胞核外與細(xì)胞核表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)，其形狀一致，這與細(xì)胞殘片染成不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。Hoechst作為熒光染色劑，從原理上來(lái)說(shuō)都可以用于DNA熒光染色檢測(cè)支原體污染，大多數(shù)學(xué)者用Hoechst33258來(lái)檢測(cè)細(xì)胞支原體污染［13-15］。也有學(xué)者用Hoechst33342對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)［16］。這兩種染色劑的不同點(diǎn)在于：后者對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些，可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Hoechst33342熒光染色檢測(cè)支原體污染，僅細(xì)胞核顯色，細(xì)胞表面及細(xì)胞周?chē)蓛?、清晰，無(wú)熒光小點(diǎn)。說(shuō)明所培養(yǎng)的云南半細(xì)毛羊HFSCs并未受到支原體污染。

除了用熒光染色法檢測(cè)支原體以外，現(xiàn)在用得比較多的方法還有PCR法檢測(cè)支原體：先采用酚氯仿法提取標(biāo)本DNA，再?gòu)?種常見(jiàn)污染細(xì)胞的支原體16sRNA中選擇2段高度保守的核酸序列作為引物，總長(zhǎng)度為472 bp，引物A：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，引物B：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。利用建立的PCR反應(yīng)體系和條件，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測(cè)儀觀(guān)察并用凝膠成像系統(tǒng)照相。此方法與DNA熒光染色法相比：敏感、特異性強(qiáng)，但價(jià)格比較昂貴。

微生物污染控制在一定程度上直接影響和反映一個(gè)國(guó)家的生物技術(shù)發(fā)展水平。所以，如何有效控制及預(yù)防微生物污染是廣大科研工作者長(zhǎng)期面臨的巨大挑戰(zhàn)和重要研究課題。

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Q813.1+1

A

2095-3887（2014）06-0046-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.013

2014-09-16

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-40-06）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目（2012FD083）

呂春榮（1982-），女，助理研究員，碩士。

洪瓊花（1968-），女，白族，研究員，碩士，主要從事綿羊、山羊的育種和高效繁殖新技術(shù)研究。