某規(guī)?；i場母豬豬瘟抗體和病原檢測與分析

張?zhí)K強林煒明戴愛玲楊小燕*

（1.福建省龍巖市農(nóng)業(yè)學(xué)校 福建龍巖 364000；2.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)高校重點實驗室 福建龍巖 364000）

某規(guī)模化豬場母豬豬瘟抗體和病原檢測與分析

張?zhí)K強1林煒明2戴愛玲2楊小燕2*

（1.福建省龍巖市農(nóng)業(yè)學(xué)校 福建龍巖 364000；2.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)高校重點實驗室 福建龍巖 364000）

為了探討母豬的豬瘟疫苗免疫情況和豬瘟病毒之間的關(guān)系，本研究采用阻斷ELISA技術(shù)和RT-PCR技術(shù)，對某規(guī)?；i場隨機(jī)采取57頭母豬的血清樣品和扁桃體樣品進(jìn)行了豬瘟抗體水平和豬瘟病毒檢測。結(jié)果表明：豬瘟抗體陽性率為74.07%，抗體離散度為41.79%，表明豬瘟抗體陽性率剛達(dá)到國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，抗體離散度偏高。豬瘟抗體和豬瘟病毒之間存在一定關(guān)系，無論豬瘟疫苗免疫是否合格，均有可能感染豬瘟野毒，豬瘟抗體陰性組，以及抗體阻斷率大于90%組中的豬瘟病毒陽性率較高。

豬瘟抗體 豬瘟病毒 免疫效果

*通訊作者：楊小燕，女，教授，主要從事動物傳染病學(xué)研究。

E-mail：lyyxy1988@126.com。

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。豬是該病唯一的自然宿主，不同品種、年齡和性別的豬均可感染。該病最主要的傳染源是患豬和帶毒豬。易感豬與患豬的直接接觸是該病的主要傳播方式。感染豬在發(fā)病前即可從口、鼻及淚腺分泌物和尿、糞中排毒，并延伸整個病程［1］。雖然我國采用豬瘟弱毒疫苗進(jìn)行免疫接種，在很大程度上控制了豬瘟的流行和發(fā)生，但近年來，慢性豬瘟和非典型豬瘟在各地仍時有發(fā)生，豬瘟仍然是當(dāng)前規(guī)?；i場需防控的重點傳染病［2］。為了解豬場母豬豬瘟疫苗免疫情況和豬瘟病毒感染情況，試驗隨機(jī)采取某規(guī)?；i場57頭母豬的血清樣品和扁桃體樣品進(jìn)行豬瘟抗體水平和豬瘟病毒RT-PCR檢測，分析豬瘟疫苗免疫合格率的狀況，以及豬瘟抗體水平和感染豬瘟野毒之間的關(guān)系，為規(guī)?；i場控制豬瘟提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機(jī)采取某規(guī)?；i場57頭母豬豬瘟疫苗免疫1個月以上的血清樣品和扁桃體樣品；CSFV抗體檢測試劑盒購于 IDEXX公司；Trizol RNA提取試劑購于Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和dNTP購于TaKaRa公司；豬瘟病毒引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增片段大小為272 bp。

1.2 儀器 96孔酶標(biāo)儀購于Thermo公司；冰箱購于海爾公司；高速冷凍離心機(jī)購于Thermo公司；梯度PCR儀購于Thermal公司；電泳儀購于北京市六一儀器廠；紫外線凝膠成像儀購于BIO-RAD公司。

1.3 ELISA檢測豬瘟抗體水平 采用ELISA技術(shù)對血清樣品進(jìn)行豬瘟抗體水平的檢測，具體操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判斷如下：抗體阻斷率≥40%，表示抗體陽性；阻斷率≤30%，表示抗體陰性；阻斷率在30%～40%，應(yīng)在數(shù)日后再對該動物重新檢測。豬群豬瘟抗體阻斷率﹥40%達(dá)到100%，或者﹥50%達(dá)到85%，離散度﹤25%，表示豬群免疫狀況很好；離散度在25%～40%表示免疫效果一般。

1.4 RT-PCR檢測豬瘟病毒 RNA提取方法參照Trizol RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系為25 uL，其中含RNA溶液16 uL，隨機(jī)引物1.4 uL，5× M-MLV buffer 4 uL，dNTP 2 uL，無菌水1 uL，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1 uL。PCR反應(yīng)體系為25 uL，其中含無菌水16 uL，10×PCR buffer 2.5 uL，dNTP Mixture 2 uL，引物1.2 uL，cDNA 3 uL，Taq DNA聚合酶0.2 uL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s；56℃退火45 s；72℃延伸1 min，35個循環(huán)。72℃再延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 uL PCR產(chǎn)物加入1 uL 6×Loading Buffer，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。最后用紫外線凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟抗體水平檢測 隨機(jī)采取某規(guī)?；i場57頭母豬豬瘟疫苗免疫1個月以上的血清樣品，采用阻斷ELISA技術(shù)對豬瘟抗體水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，豬瘟抗體陽性率為74.07%，抗體離散度為41.79%，平均抗體阻斷率為54.38。按照國家豬瘟強制免疫抗體陽性率應(yīng)在70%以上才能判定為群體免疫效果合格的標(biāo)準(zhǔn)［3］，該場的豬瘟抗體陽性率剛能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，但抗體離散度偏高。

2.2 豬瘟病原檢測 采用RT-PCR技術(shù)對該場隨機(jī)采取的57頭母豬血清樣品和扁桃體樣品進(jìn)行豬瘟病毒檢測，若呈病毒陽性將出現(xiàn)大小為272 bp的一條特異性條帶。結(jié)果表明，有4頭母豬已感染豬瘟病毒，豬瘟病毒陽性率為7%。豬群中有極少部分外表看似健康的豬存在隱性感染豬瘟病毒。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

2.3 豬瘟抗體和病原之間的關(guān)系 采用阻斷ELISA和RT-PCR技術(shù)對該場隨機(jī)采取的57頭母豬的血清樣品和扁桃體樣品進(jìn)行了豬瘟抗體水平和豬瘟病毒檢測，分析豬瘟抗體水平和感染豬瘟野毒之間的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)豬瘟抗體阻斷率為≤30%時（豬瘟抗體陰性），豬瘟病毒陽性率為14.3%；當(dāng)豬瘟抗體阻斷率在30%～90%時，豬瘟病毒陽性率為2%；豬瘟抗體阻斷率大于90%時，豬瘟病毒陽性率為66.7%?？梢姡瑹o論豬瘟疫苗免疫是否合格，豬群均有可能感染豬瘟病毒。豬瘟抗體陰性組，以及抗體阻斷率大于90%組中的豬瘟病毒陽性率較高。

3 討論

1）近年來，雖然規(guī)?；i場典型急性豬瘟大面積流行已少見，但非典型豬瘟仍然普遍存在，種豬群帶毒是造成我國豬瘟長期持續(xù)存在及流行惡性循環(huán)的主要根源。豬瘟疫苗無論在過去、現(xiàn)在還是將來，對控制豬瘟具有重要意義，但在疫苗接種面越來越廣，防疫密度越來越高，免疫劑量加大和免疫次數(shù)增加的情況下，仍未能有效控制豬瘟的發(fā)生，而且，近年來不少豬場存在豬群免疫反應(yīng)低下現(xiàn)象［4］。本試驗中，對該規(guī)?；i場母豬的豬瘟抗體水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示豬瘟疫苗的免疫效果一般，豬瘟抗體陽性率剛達(dá)到國家豬瘟強制免疫抗體合格率應(yīng)保存在70%以上的要求［3］?？贵w離散度依然偏高，豬群中個體之間的豬瘟抗體水平存在較大差異。

2）在規(guī)?；i場實施以凈化種豬為主的豬瘟綜合防控措施是當(dāng)前有效控制豬瘟的重要手段。目前，凈化豬瘟的方法主要有抗體檢測方法和病原檢測方法?？贵w檢測方法即通過對豬群進(jìn)行豬瘟抗體水平的檢測，對首次豬瘟抗體檢測不合格的所有豬只加強免疫豬瘟疫苗1次，4周后再次采血檢測，對豬瘟抗體檢測再次不合格的豬只進(jìn)行淘汰。修金生等研究表明，淘汰加強免疫后豬瘟抗體水平不合格的種豬后，可以顯著提高豬場母豬繁殖性能和小豬的生產(chǎn)性能［5］。病原檢測方法即通過對豬群進(jìn)行豬瘟病毒檢測，淘汰陽性帶毒豬，陰性豬進(jìn)行加強免疫。周緒斌等通過采集活體的扁桃體，運用豬瘟免疫熒光技術(shù)檢測豬瘟的方法凈化豬瘟，經(jīng)過2～3次凈化，豬瘟陽性率下降至3%以下［6］。本試驗采用ELISA技術(shù)和RT-PCR技術(shù)探討豬瘟抗體水平和感染豬瘟野毒之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)當(dāng)豬瘟抗體陰性時，豬瘟病毒陽性率為14.3%，阻斷率在30%～90%時，陽性率為2%，說明母豬當(dāng)豬瘟抗體陰性時豬瘟病毒陽性率更高。一些研究也表明豬瘟病毒的隱性感染或持續(xù)性感染會干擾豬瘟疫苗的免疫效果，從而影響豬體的免疫保護(hù)力［7］。豬瘟病毒通過調(diào)節(jié)機(jī)體重要的共刺激分子和細(xì)胞因子的分泌，下調(diào)樹突狀細(xì)胞的成熟，使病毒逃逸宿主防御機(jī)制［8］。本試驗也表明豬瘟免疫抗體水平合格也會感染豬瘟病毒，但感染率較低。覃紹敏等通過熒光抗體技術(shù)和ELISA方法也發(fā)現(xiàn)無論豬瘟免疫抗體水平是否合格，均有可能感染豬瘟野毒，感染率隨著阻斷率的升高而降低［9］。因此，在實際中豬瘟抗體水平只能體現(xiàn)豬群的免疫狀況，并不能根據(jù)抗體水平高低來判斷母豬是否感染豬瘟病毒。本研究還發(fā)現(xiàn)，豬瘟抗體阻斷率大于90%時，豬瘟病毒陽性率最高。夏燕華等研究表明CSF抗體水平過高能抑制IFN啟動子的活化，直接影響機(jī)體抗病毒的功能，是病毒建立持續(xù)感染的重要原因［10］。

3）以上結(jié)果表明，豬瘟抗體陰性組，以及抗體阻斷率大于90%組中的豬瘟病毒陽性率較高，其結(jié)果為有效控制豬瘟提供重要科學(xué)依據(jù)。母豬感染豬瘟病毒后引起豬瘟抗體水平的變化是一個復(fù)雜的過程，在今后的研究中仍有待進(jìn)一步探討。

［1］ 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：210-212.

［2］ 涂宜強，簡永利，白宇，等.浙江部分地區(qū)豬瘟流行現(xiàn)狀的調(diào)查與分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2013，25（4）：728-732.

［3］ 農(nóng)業(yè)部.農(nóng)醫(yī)發(fā)（2013）8號：農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《2013年國家動物疫病強制免疫計劃》的通知［EB/OL］.http：//www. moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201303/t20130307_3248256. html.

［4］ 趙永美，夏田，牛木存，等.云南部分規(guī)?；N豬豬瘟疫苗接種效果檢測及分析［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，28（5）：755-757.

［5］ 修金生，吳順意，周倫江，等.淘汰豬瘟抗體不合格種豬對母豬繁殖性能和仔豬生產(chǎn)性能的影響研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2010，26（20）：1-6.

［6］ 周緒斌，趙亞榮，許秀梅，等.規(guī)?；i場豬瘟的凈化與防制［J］.養(yǎng)豬，2006（3）：44-46.

［7］ 胡永明，趙明秋，陳立軍，等.豬瘟病毒感染對豬外周血T淋巴細(xì)胞亞群及TNF-α和IFN-γ的影響［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33（2）：126-129.

［8］ CHEN L J，DONG X Y，SHEN H Y，et al.Classical swine fever virus suppressed maturation and modulates functions of monocyte-derived dendritic cells without activating nuclear factor kappa B［J］.Research in Veterinary science，2012，93（1）：529-537.

［9］ 覃紹敏，馬玲，吳健敏，等.某規(guī)?；i場豬瘟抗體水平及其野毒感染的檢測與分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（9）：92-94.

［10］ 夏燕華，趙天生.豬瘟病毒對IFN-β啟動子活化［J］.南昌大學(xué)學(xué)報，2012，36（4）：394-397.

The detection of CSF antibody and CSFV in a certain scale pig farm

Zhang Suqiang1Lin Weiming2Dai Ailing2Yang Xiaoyan2*
（1.Longyan Agricultural School，F(xiàn)ujian 364000;2.College of Life Sciences of Longyan University，Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Veterinary Biotechnology，Longyan，F(xiàn)ujian 364000）

To investigation the relationships between CSF antibody and CSFV，blood samples and tonsils were randomly collected from 57 sows in a certain scale pig farm.CSF antibody levels and CSFV were confirmed by ELISA and RT-PCR.The positive rate of CSF antibody was 74.7%and coefficient of variation of antibody was 41.79%.It indicated that the positive rate of CSF antibody just reached state specified standards.There were relationships between the CSF antibody level and CSFV.Sows may be infected with CSFV regardless of CSF antibody level.The positive rate of CSF antibody was high in CSF antibody-negative group and antibody blocking rate（more than 90%）group.

CSF antibody CSFV immunity effect

A

1003-4331（2014）01-0001-03

福建省科技計劃重點項目（2013N0026）、龍巖市科技計劃項目（2011LY18）資助。

張?zhí)K強，男，高級講師。