林建明等
[摘要] 目的 探討1,25-(OH)2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)膠原蛋白Ⅲ(ColⅢ)表達(dá)的影響。 方法 將實驗動物按隨機數(shù)字表法分為3組(n=7):假手術(shù)組(對照組)、進(jìn)展性腎炎組(模型組)、6 ng/(100 g·d) 1,25-(OH)2-D3干預(yù)組(治療組)。除對照組外,其余組均采用右腎切除并2次注射IgG(OX-7)鼠抗人Thy1.1單克隆抗體,制備進(jìn)展性腎炎大鼠模型。1,25-(OH)2-D3干預(yù)8周后,檢測各組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及電解質(zhì)的變化,Masson染色觀察腎組織病理改變。免疫組織化學(xué)檢測腎小管間質(zhì)ColⅢ的表達(dá)。 結(jié)果 與模型組比較,1,25-(OH)2-D3治療不僅使大鼠24 h尿蛋白及BUN均明顯降低(P<0.05),還能使ColⅢ表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。腎組織病理損害明顯減輕。 結(jié)論 1,25-(OH)2-D3可能通過明顯降低進(jìn)展性腎炎大鼠腎小管間質(zhì)ColⅢ的表達(dá),減輕腎小管間質(zhì)纖維化而發(fā)揮腎臟保護作用。
[關(guān)鍵詞] 1,25-(OH)2-D3;ColⅢ;進(jìn)展性腎炎;腎小管間質(zhì)纖維化;大鼠
[中圖分類號] R692.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721(2014)02(a)-0004-04
腎小管間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積容易引起腎功能不全,常見于許多慢性腎臟疾病。間質(zhì)膠原,尤其是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原,通常作為腎組織基底膜的“腳手架”而普遍存在于腎臟中[1-2]。膠原及其相關(guān)分子在腎小管間質(zhì)的積聚即可以定義為腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)。腎小管間質(zhì)纖維化的病變程度嚴(yán)重影響了腎功能的正常運作。延緩或阻止腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展,可以預(yù)防慢性腎臟病的發(fā)生[3]。1,25-(OH)2-D3除調(diào)節(jié)鈣磷代謝外,在調(diào)節(jié)各種生物過程(如免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和分化、抗纖維化、減少尿蛋白)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[4]。但是,1,25-(OH)2-D3對進(jìn)展性腎炎腎小管間質(zhì)纖維化的保護作用尚不完全清楚。本研究旨在探討1,25-(OH)2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠模型中RIF膠原蛋白Ⅲ(ColⅢ)表達(dá)的影響,并觀察腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的改變,便于進(jìn)一步了解1,25-(OH)2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠RIF的可能作用途徑及影響機制。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1,25-(OH)2-D3購自美國Sigma公司,IgG(OX-7)鼠抗人Thy1.1單克隆抗體購于美國Neo Markers公司,大鼠ColⅢ免疫組織化學(xué)試劑盒購于武漢BOSTER生物工程有限公司。
1.2 儀器
全自動多功能生化分析儀(日本Hitachi公司);光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。
1.3 動物模型制備及分組
雄性SD大鼠(重慶騰鑫生物技術(shù)公司提供,二級)21只,體重(131.2±10.0) g。將21只大鼠按隨機數(shù)字表法分為3組(n=7):假手術(shù)組(對照組,只做腎包膜剝離,不予腎臟切除)、進(jìn)展性腎炎組(模型組)、6 ng/(100 g·d) 1,25-(OH)2-D3干預(yù)組(治療組),選用進(jìn)展性腎炎模型參照參考文獻(xiàn)[4],行右腎摘除術(shù),分別于術(shù)后第1、2周予尾靜脈注射IgG(OX-7)鼠抗人Thy1.1單克隆抗體1.2 mg/(kg·d),共2次。1,25-(OH)2-D3干預(yù)組于術(shù)后予1,25-(OH)2-D3 6 ng/(100 g·d)入飲水中灌胃至8周。所有大鼠均于8周后處死,收集24 h尿液,取大鼠心臟血并制作腎組織標(biāo)本。
1.4 觀察指標(biāo)與方法
1.4.1 24 h尿蛋白定量 處死大鼠前3 d,將大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液,每只收集3次,用雙縮脲法測定尿蛋白含量,求平均尿蛋白含量。
1.4.2 血生化檢測 取大鼠心臟血清,測定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、鈣、磷等。
1.4.3 腎臟組織病理學(xué)檢查 腎組織以10%甲醛固定并編號,石蠟包被,2 μm厚連續(xù)切片,Masson染色,光鏡下觀察腎臟病理改變。細(xì)胞核染黑藍(lán)色,膠原纖維呈綠色,肌纖維、紅細(xì)胞呈紅色。
1.4.4 免疫組織化學(xué)法檢測 ColⅢ蛋白的表達(dá):取2 μm厚石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,滅活內(nèi)原性酶,熱修復(fù)抗原,抗原抗體反應(yīng),DAB顯色、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。陽性產(chǎn)物呈深褐色,不加抗體為陰性對照。
1.4.5 免疫組織化學(xué)分析 采用顯微圖像分析系統(tǒng)(Olympus C3040-ADU)對各組染色結(jié)果進(jìn)行積分光密度值(integral optical density,IOD)測定,每張切片隨機選取10個高倍視野,每個視野代表0.13 mm2的區(qū)域面積,計算其IOD值,取平均值。
1.5 統(tǒng)計學(xué)方法
所得數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,經(jīng)方差齊性檢驗,再進(jìn)行兩獨立樣本均數(shù)t檢驗和組內(nèi)的方差分析,檢驗水準(zhǔn)α=0.05。
2 結(jié)果
2.1 1,25-(OH)2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠24 h尿蛋白、腎功能的影響
術(shù)后8周,模型組24 h尿蛋白量、SCr和BUN均顯著高于對照組(P<0.05)。經(jīng)1,25-(OH)2-D3干預(yù)治療后,與模型組比較,24 h尿蛋白量、BUN均顯著降低(P<0.05),兩組間SCr差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療前后電解質(zhì)鈣、磷水平在治療組無明顯變化(P>0.05)(表1)。
表1 3組大鼠各項檢測指標(biāo)的比較(x±s)
與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05
2.2 1,25-(OH)2-D3對腎組織病理變化的影響
Masson染色(圖1)顯示,對照組腎小管間質(zhì)形態(tài)基本正常;模型組見腎小管上皮細(xì)胞萎縮、脫落,腎小管管腔擴張、間質(zhì)膠原纖維增厚。與對照組比較,模型組間質(zhì)炎癥和纖維化進(jìn)行性加重。與模型組比較,治療組腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常,間質(zhì)炎癥得到改善,膠原纖維積聚減少。
2.3 1,25-(OH)2-D3對進(jìn)展性腎炎大鼠腎間質(zhì)ColⅢ蛋白表達(dá)的影響
ColⅢ蛋白表達(dá)主要集中于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì),模型組腎間質(zhì)ColⅢ蛋白表達(dá)較對照組顯著增多(P<0.01),應(yīng)用1,25-(OH)2-D3治療后,ColⅢ表達(dá)均較模型組明顯減少(P<0.05)(圖2)。
3 討論
腎臟纖維化是一個常見的導(dǎo)致腎臟功能衰竭的終末事件。因此,了解腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程對腎臟疾病的早期干預(yù)治療有重大意義。近年來研究證實,一種活性維生素D3類似物——帕立骨化三醇可以減緩單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠模型中間質(zhì)纖維化、抑制腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[5]、改善腎臟炎癥[6-7],減少尿蛋白,抑制足細(xì)胞損傷[8]。因而,本研究觀察了進(jìn)展性腎炎1,25-(OH)2-D3通過抑制RIF ColⅢ的表達(dá),發(fā)揮進(jìn)展性腎炎抗纖維化的保護作用。
本研究中,Masson染色結(jié)果顯示,模型組腎小管上皮細(xì)胞萎縮、脫落,腎小管管腔擴張、間質(zhì)膠原纖維增厚,與對照組比較,模型組間質(zhì)炎癥和纖維化進(jìn)行性加重,證實系膜增生性腎炎模型大鼠是目前觀察進(jìn)展性腎炎比較理想的動物模型[9-10]。生化指標(biāo)顯示,模型組24 h尿蛋白含量、SCr、BUN均較對照組明顯升高,表明進(jìn)展性腎炎的大鼠模型造模成功。在予以1,25-(OH)2-D3干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn),與模型組相比,24 h尿蛋白含量及BUN均降低,提示1,25-(OH)2-D3可以減少進(jìn)展性腎炎大鼠模型中的尿蛋白含量、抑制腎臟纖維化,提高腎臟功能。另外,本實驗還監(jiān)測了血電解質(zhì)鈣、磷的變化,發(fā)現(xiàn)在給予1,25-(OH)2-D3治療前后,鈣、磷無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,表明該1,25-(OH)2-D3的實驗濃度[11]不會引起鈣、磷代謝紊亂,從而干擾實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。
ColⅢ是腎組織基底膜的重要組成成分,對維持基底膜的完整性發(fā)揮重要作用[12]。ColⅢ表達(dá)的過多或過少均提示腎組織基底膜的結(jié)構(gòu)及完整性發(fā)生了改變。在腎組織基底膜中,腎間質(zhì)基底膜占其總量的85%~90%[13]。本研究中亦發(fā)現(xiàn)進(jìn)展性腎炎大鼠模型腎間質(zhì)組織中ColⅢ表達(dá)較對照組明顯增加,而應(yīng)用1,25-(OH)2-D3干預(yù)后,ColⅢ表達(dá)明顯下降,進(jìn)一步提示了1,25-(OH)2-D3可能通過ColⅢ表達(dá)減少,減輕RIF的發(fā)生、發(fā)展。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),進(jìn)展性腎炎大鼠模型腎間質(zhì)組織中結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達(dá)增加,該因子又是公認(rèn)的較強的促纖維化生長因子[14],可促進(jìn)細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),如ColⅢ[15]、纖連蛋白和整合素α5顯著增加[16],提示1,25-(OH)2-D3降低ColⅢ的表達(dá)可能通過抑制腎小管間質(zhì)組織中CTGF的表達(dá)發(fā)揮作用。
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(收稿日期:2013-11-01 本文編輯:林利利)
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(收稿日期:2013-11-01 本文編輯:林利利)