以環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷為“假載體”印跡識別蛋白質(zhì)的研究

張蕓　郭敏杰等

摘要 實驗以聚乙烯醇分子為客體分子，與γ環(huán)糊精（γCD）分子組裝制備環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷（CDPPRs）；在金屬離子存在下，以丙烯酰胺（AM）為單體，N，N亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以CDPPRs為“假載體”，制備了以牛血清白蛋白（BSA）為模板的分子印跡聚合物（cpMIP）。結(jié)果表明，隨著功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印跡聚合物吸附量先增加后減小，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為0.55時，印跡聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存時，吸附量最高可達5.16 mg/g；將cpMIP用于4種混合蛋白溶液吸附，結(jié)果表明， 引入CDPPRs使印跡聚合物的特異性吸附能力明顯提高，特異性吸附量可提高約6倍。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 聚乙烯醇； 環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷； 假載體； 蛋白質(zhì)吸附

1引言

蛋白質(zhì)分子印跡聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通過功能單體交聯(lián)聚合而成[1，2]，MIPs可以選擇性地從混合物中吸附分離模板蛋白，其制備方法主要有包埋法[3]、表面印跡法[4]，抗原決定基法[5]、輔助識別鏈輔助法[6，7]、碳納米管為載體法[8]及借助某些物質(zhì)或載體在二維或三維空間上進行蛋白質(zhì)印跡[9]方法等。環(huán)糊精（CD）與鏈狀大分子通過非共價鍵相互作用組裝超分子聚集體，可形成準(zhǔn)聚輪烷或者聚輪烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印跡氨基酸、多肽的研究較多[11]，用于蛋白質(zhì)分子印跡的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅膠為載體，將βCD與丙烯酰胺進行鍵合制備MIPs。Nagaoka等[14]將環(huán)糊精引入印跡體系，以三肽為模板分子，分別在硅膠、氧化鋁薄膜及聚羥乙基丙烯酸甲酯表面制備了印跡聚合物。

本實驗將環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷充當(dāng)“假載體”，參與交聯(lián)聚合過程而被固定在聚合物網(wǎng)絡(luò)中，以實現(xiàn)功能單體與目標(biāo)分子良好的空間匹配，從而達到對模板蛋白的專一性識別[15]。印跡吸附過程見圖1。本實驗提出的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷這種“假載體”有別于小分子單體，由于CD是低聚環(huán)狀物，結(jié)構(gòu)類似一截頂圓錐，它能夠在體系聚合過程中在橫向和縱向空間上較好的維持與蛋白質(zhì)匹配的空間結(jié)構(gòu)而區(qū)別于普通的包埋法印跡。CD的空腔直徑約為1 nm，其縱向尺寸也不超過10 nm， 因此對多數(shù)三維線長在10 nm這個數(shù)量級上的蛋白質(zhì)而言， CDPPRs并不提供一個真正的載體作用，因而稱之為“假載體”。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

DYCZ24DN型電泳儀（北京市六一儀器廠）； TU1800PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； MIPAⅡXMU/H掃描電鏡（美國SIRION公司）。

聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ環(huán)糊精（γCD， 藥品級， 德國Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V組分（BSA）、大豆蛋白酶抑制劑（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2實驗方法

2.2.1CDPPRs的制備稱1.00 g PVA于100 mL圓底燒瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室溫下靜置12 h，循環(huán)5次。將反應(yīng)物用乙醇沉淀，經(jīng)水洗、分離、真空干燥，制得CDPPRs。稱2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亞砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗滌，真空干燥后得到CDPPRsAc。

2.2.2印跡聚合物MIPs的制備依次將丙烯酰胺AM、N，N′亞甲基雙丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到裝有20.0 mL去離子水的三口燒瓶中，冰水浴中攪拌1 h，通氮氣，加入過硫酸銨（APS），繼續(xù)攪拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反應(yīng)4 h，得到cpMIPs。空白印跡聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同；對比組印跡聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同。

2.2.3 印跡聚合物吸附性能測試（1）吸附動力學(xué)實驗將各組MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上層清液1.0 mL，檢測MIPs對模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）競爭吸附實驗稱取1.00 g 各組MIPs，加入到10 mL蛋白質(zhì)混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL濃度均為0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗滌。取洗脫蛋白液各10 μL上樣，恒流條件下進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用考馬斯藍染色進行分析。

3結(jié)果與討論

3.1CDPPRs結(jié)構(gòu)分析

CD為高旋光性物質(zhì)，PVA旋光度為零，當(dāng)兩者形成組裝體后，分子的空間形象及分子對稱性發(fā)生了較大的改變。兩者混合物的比旋光度與γCD的比旋光度相同，均為+175°；而組裝體的比旋光度為+85°，初步證明聚乙烯醇與γ環(huán)糊精進行了包結(jié)。

CDPPRs的核磁譜圖（圖2c）進一步證明主客體間的各種弱作用相互疊加形成了較強的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的質(zhì)子和PVA分子鏈上與羥基相連碳上的質(zhì)子的共同貢獻，對比圖2b與2c可見，該部分貢獻并不是γCD與聚乙烯醇兩種物質(zhì)質(zhì)子的簡單物理加和，峰形已經(jīng)發(fā)生變化。

3.2蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備

3.2.1CDPPRsAc的含量對MIPs吸附量的影響在實驗范圍內(nèi)，隨著CDPPRsAc用量的增加，印跡聚合物的吸附量增大（圖4），這應(yīng)歸因于環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷的引入使識別位點增多。當(dāng)CDPPRsAc用量繼續(xù)增加時，印跡聚合物的吸附量下降，這可能是因為過多的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷使得印跡聚合物的交聯(lián)過于密集，不利于印跡聚合物的識別。在實驗范圍內(nèi)，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為1.1時，此時的印跡聚合物的吸附量最大，為3.54 mg/g。

3.2.2金屬離子用量對MIPs吸附量的影響金屬離子可以特異性地鍵合蛋白質(zhì)的某些官能團。分別使用Ni2+和Cu2+輔助蛋白質(zhì)印跡識別過程，金屬離子與模板所形成的空間取向，在環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷所在的聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中能夠被較好地保留下來，因此可提高對模板分子的選擇性識別（表1）。加入金屬離子的MIPs比未加入金屬離子的MIPs吸附量高，這可能是因為加入金屬離子后，CDPPRAc、功能單體與模板蛋白之間可以通過金屬離子形成穩(wěn)定的配位作用，從而產(chǎn)生了更多的有效識別位點，提高對模板蛋白的識別能力。實驗范圍內(nèi)，引入Cu2+的MIPs對模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。

摘要 實驗以聚乙烯醇分子為客體分子，與γ環(huán)糊精（γCD）分子組裝制備環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷（CDPPRs）；在金屬離子存在下，以丙烯酰胺（AM）為單體，N，N亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以CDPPRs為“假載體”，制備了以牛血清白蛋白（BSA）為模板的分子印跡聚合物（cpMIP）。結(jié)果表明，隨著功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印跡聚合物吸附量先增加后減小，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為0.55時，印跡聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存時，吸附量最高可達5.16 mg/g；將cpMIP用于4種混合蛋白溶液吸附，結(jié)果表明， 引入CDPPRs使印跡聚合物的特異性吸附能力明顯提高，特異性吸附量可提高約6倍。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 聚乙烯醇； 環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷； 假載體； 蛋白質(zhì)吸附

1引言

蛋白質(zhì)分子印跡聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通過功能單體交聯(lián)聚合而成[1，2]，MIPs可以選擇性地從混合物中吸附分離模板蛋白，其制備方法主要有包埋法[3]、表面印跡法[4]，抗原決定基法[5]、輔助識別鏈輔助法[6，7]、碳納米管為載體法[8]及借助某些物質(zhì)或載體在二維或三維空間上進行蛋白質(zhì)印跡[9]方法等。環(huán)糊精（CD）與鏈狀大分子通過非共價鍵相互作用組裝超分子聚集體，可形成準(zhǔn)聚輪烷或者聚輪烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印跡氨基酸、多肽的研究較多[11]，用于蛋白質(zhì)分子印跡的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅膠為載體，將βCD與丙烯酰胺進行鍵合制備MIPs。Nagaoka等[14]將環(huán)糊精引入印跡體系，以三肽為模板分子，分別在硅膠、氧化鋁薄膜及聚羥乙基丙烯酸甲酯表面制備了印跡聚合物。

本實驗將環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷充當(dāng)“假載體”，參與交聯(lián)聚合過程而被固定在聚合物網(wǎng)絡(luò)中，以實現(xiàn)功能單體與目標(biāo)分子良好的空間匹配，從而達到對模板蛋白的專一性識別[15]。印跡吸附過程見圖1。本實驗提出的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷這種“假載體”有別于小分子單體，由于CD是低聚環(huán)狀物，結(jié)構(gòu)類似一截頂圓錐，它能夠在體系聚合過程中在橫向和縱向空間上較好的維持與蛋白質(zhì)匹配的空間結(jié)構(gòu)而區(qū)別于普通的包埋法印跡。CD的空腔直徑約為1 nm，其縱向尺寸也不超過10 nm， 因此對多數(shù)三維線長在10 nm這個數(shù)量級上的蛋白質(zhì)而言， CDPPRs并不提供一個真正的載體作用，因而稱之為“假載體”。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

DYCZ24DN型電泳儀（北京市六一儀器廠）； TU1800PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； MIPAⅡXMU/H掃描電鏡（美國SIRION公司）。

聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ環(huán)糊精（γCD， 藥品級， 德國Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V組分（BSA）、大豆蛋白酶抑制劑（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2實驗方法

2.2.1CDPPRs的制備稱1.00 g PVA于100 mL圓底燒瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室溫下靜置12 h，循環(huán)5次。將反應(yīng)物用乙醇沉淀，經(jīng)水洗、分離、真空干燥，制得CDPPRs。稱2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亞砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗滌，真空干燥后得到CDPPRsAc。

2.2.2印跡聚合物MIPs的制備依次將丙烯酰胺AM、N，N′亞甲基雙丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到裝有20.0 mL去離子水的三口燒瓶中，冰水浴中攪拌1 h，通氮氣，加入過硫酸銨（APS），繼續(xù)攪拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反應(yīng)4 h，得到cpMIPs?？瞻子≯E聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同；對比組印跡聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同。

2.2.3 印跡聚合物吸附性能測試（1）吸附動力學(xué)實驗將各組MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上層清液1.0 mL，檢測MIPs對模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）競爭吸附實驗稱取1.00 g 各組MIPs，加入到10 mL蛋白質(zhì)混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL濃度均為0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗滌。取洗脫蛋白液各10 μL上樣，恒流條件下進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用考馬斯藍染色進行分析。

3結(jié)果與討論

3.1CDPPRs結(jié)構(gòu)分析

CD為高旋光性物質(zhì)，PVA旋光度為零，當(dāng)兩者形成組裝體后，分子的空間形象及分子對稱性發(fā)生了較大的改變。兩者混合物的比旋光度與γCD的比旋光度相同，均為+175°；而組裝體的比旋光度為+85°，初步證明聚乙烯醇與γ環(huán)糊精進行了包結(jié)。

CDPPRs的核磁譜圖（圖2c）進一步證明主客體間的各種弱作用相互疊加形成了較強的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的質(zhì)子和PVA分子鏈上與羥基相連碳上的質(zhì)子的共同貢獻，對比圖2b與2c可見，該部分貢獻并不是γCD與聚乙烯醇兩種物質(zhì)質(zhì)子的簡單物理加和，峰形已經(jīng)發(fā)生變化。

3.2蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備

3.2.1CDPPRsAc的含量對MIPs吸附量的影響在實驗范圍內(nèi)，隨著CDPPRsAc用量的增加，印跡聚合物的吸附量增大（圖4），這應(yīng)歸因于環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷的引入使識別位點增多。當(dāng)CDPPRsAc用量繼續(xù)增加時，印跡聚合物的吸附量下降，這可能是因為過多的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷使得印跡聚合物的交聯(lián)過于密集，不利于印跡聚合物的識別。在實驗范圍內(nèi)，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為1.1時，此時的印跡聚合物的吸附量最大，為3.54 mg/g。

3.2.2金屬離子用量對MIPs吸附量的影響金屬離子可以特異性地鍵合蛋白質(zhì)的某些官能團。分別使用Ni2+和Cu2+輔助蛋白質(zhì)印跡識別過程，金屬離子與模板所形成的空間取向，在環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷所在的聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中能夠被較好地保留下來，因此可提高對模板分子的選擇性識別（表1）。加入金屬離子的MIPs比未加入金屬離子的MIPs吸附量高，這可能是因為加入金屬離子后，CDPPRAc、功能單體與模板蛋白之間可以通過金屬離子形成穩(wěn)定的配位作用，從而產(chǎn)生了更多的有效識別位點，提高對模板蛋白的識別能力。實驗范圍內(nèi)，引入Cu2+的MIPs對模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。

摘要 實驗以聚乙烯醇分子為客體分子，與γ環(huán)糊精（γCD）分子組裝制備環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷（CDPPRs）；在金屬離子存在下，以丙烯酰胺（AM）為單體，N，N亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以CDPPRs為“假載體”，制備了以牛血清白蛋白（BSA）為模板的分子印跡聚合物（cpMIP）。結(jié)果表明，隨著功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印跡聚合物吸附量先增加后減小，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為0.55時，印跡聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存時，吸附量最高可達5.16 mg/g；將cpMIP用于4種混合蛋白溶液吸附，結(jié)果表明， 引入CDPPRs使印跡聚合物的特異性吸附能力明顯提高，特異性吸附量可提高約6倍。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 聚乙烯醇； 環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷； 假載體； 蛋白質(zhì)吸附

1引言

蛋白質(zhì)分子印跡聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通過功能單體交聯(lián)聚合而成[1，2]，MIPs可以選擇性地從混合物中吸附分離模板蛋白，其制備方法主要有包埋法[3]、表面印跡法[4]，抗原決定基法[5]、輔助識別鏈輔助法[6，7]、碳納米管為載體法[8]及借助某些物質(zhì)或載體在二維或三維空間上進行蛋白質(zhì)印跡[9]方法等。環(huán)糊精（CD）與鏈狀大分子通過非共價鍵相互作用組裝超分子聚集體，可形成準(zhǔn)聚輪烷或者聚輪烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印跡氨基酸、多肽的研究較多[11]，用于蛋白質(zhì)分子印跡的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅膠為載體，將βCD與丙烯酰胺進行鍵合制備MIPs。Nagaoka等[14]將環(huán)糊精引入印跡體系，以三肽為模板分子，分別在硅膠、氧化鋁薄膜及聚羥乙基丙烯酸甲酯表面制備了印跡聚合物。

本實驗將環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷充當(dāng)“假載體”，參與交聯(lián)聚合過程而被固定在聚合物網(wǎng)絡(luò)中，以實現(xiàn)功能單體與目標(biāo)分子良好的空間匹配，從而達到對模板蛋白的專一性識別[15]。印跡吸附過程見圖1。本實驗提出的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷這種“假載體”有別于小分子單體，由于CD是低聚環(huán)狀物，結(jié)構(gòu)類似一截頂圓錐，它能夠在體系聚合過程中在橫向和縱向空間上較好的維持與蛋白質(zhì)匹配的空間結(jié)構(gòu)而區(qū)別于普通的包埋法印跡。CD的空腔直徑約為1 nm，其縱向尺寸也不超過10 nm， 因此對多數(shù)三維線長在10 nm這個數(shù)量級上的蛋白質(zhì)而言， CDPPRs并不提供一個真正的載體作用，因而稱之為“假載體”。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

DYCZ24DN型電泳儀（北京市六一儀器廠）； TU1800PC紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； MIPAⅡXMU/H掃描電鏡（美國SIRION公司）。

聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ環(huán)糊精（γCD， 藥品級， 德國Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V組分（BSA）、大豆蛋白酶抑制劑（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2實驗方法

2.2.1CDPPRs的制備稱1.00 g PVA于100 mL圓底燒瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室溫下靜置12 h，循環(huán)5次。將反應(yīng)物用乙醇沉淀，經(jīng)水洗、分離、真空干燥，制得CDPPRs。稱2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亞砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗滌，真空干燥后得到CDPPRsAc。

2.2.2印跡聚合物MIPs的制備依次將丙烯酰胺AM、N，N′亞甲基雙丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到裝有20.0 mL去離子水的三口燒瓶中，冰水浴中攪拌1 h，通氮氣，加入過硫酸銨（APS），繼續(xù)攪拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反應(yīng)4 h，得到cpMIPs?？瞻子≯E聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同；對比組印跡聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同。

2.2.3 印跡聚合物吸附性能測試（1）吸附動力學(xué)實驗將各組MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上層清液1.0 mL，檢測MIPs對模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）競爭吸附實驗稱取1.00 g 各組MIPs，加入到10 mL蛋白質(zhì)混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL濃度均為0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗滌。取洗脫蛋白液各10 μL上樣，恒流條件下進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用考馬斯藍染色進行分析。

3結(jié)果與討論

3.1CDPPRs結(jié)構(gòu)分析

CD為高旋光性物質(zhì)，PVA旋光度為零，當(dāng)兩者形成組裝體后，分子的空間形象及分子對稱性發(fā)生了較大的改變。兩者混合物的比旋光度與γCD的比旋光度相同，均為+175°；而組裝體的比旋光度為+85°，初步證明聚乙烯醇與γ環(huán)糊精進行了包結(jié)。

CDPPRs的核磁譜圖（圖2c）進一步證明主客體間的各種弱作用相互疊加形成了較強的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的質(zhì)子和PVA分子鏈上與羥基相連碳上的質(zhì)子的共同貢獻，對比圖2b與2c可見，該部分貢獻并不是γCD與聚乙烯醇兩種物質(zhì)質(zhì)子的簡單物理加和，峰形已經(jīng)發(fā)生變化。

3.2蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備

3.2.1CDPPRsAc的含量對MIPs吸附量的影響在實驗范圍內(nèi)，隨著CDPPRsAc用量的增加，印跡聚合物的吸附量增大（圖4），這應(yīng)歸因于環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷的引入使識別位點增多。當(dāng)CDPPRsAc用量繼續(xù)增加時，印跡聚合物的吸附量下降，這可能是因為過多的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷使得印跡聚合物的交聯(lián)過于密集，不利于印跡聚合物的識別。在實驗范圍內(nèi)，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為1.1時，此時的印跡聚合物的吸附量最大，為3.54 mg/g。

3.2.2金屬離子用量對MIPs吸附量的影響金屬離子可以特異性地鍵合蛋白質(zhì)的某些官能團。分別使用Ni2+和Cu2+輔助蛋白質(zhì)印跡識別過程，金屬離子與模板所形成的空間取向，在環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷所在的聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中能夠被較好地保留下來，因此可提高對模板分子的選擇性識別（表1）。加入金屬離子的MIPs比未加入金屬離子的MIPs吸附量高，這可能是因為加入金屬離子后，CDPPRAc、功能單體與模板蛋白之間可以通過金屬離子形成穩(wěn)定的配位作用，從而產(chǎn)生了更多的有效識別位點，提高對模板蛋白的識別能力。實驗范圍內(nèi)，引入Cu2+的MIPs對模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。