衰減全反射紅外成像研究聚乳酸/生物活性玻璃復(fù)合材料的體外礦化過程

王倩　姜小婷　辛韻子　崔俊先　張普敦

摘 要 采用衰減全反射紅外成像技術(shù)（ATRFTIR mapping）對多孔聚乳酸/生物活性玻璃（PLLA/BG）復(fù)合材料在PBS緩沖液中的礦化過程進行了研究。光譜分辨率為8 cm

Symbolm@@ 1，累加掃描8次，基于A1044/A1755的吸光度比值生成紅外圖像。成像結(jié)果表明，隨著礦化進行，材料表面產(chǎn)生的羥基磷灰石（HA）也逐漸增多，當(dāng)?shù)V化進行到84 d后，材料表面大部分已被HA覆蓋。但隨著礦化時間的繼續(xù)延長，礦化不均勻性也逐漸加劇。礦化曲線顯示礦化過程存在4個階段：礦化初期（前21 d），產(chǎn)生的HA很少；礦化增長期（21～70 d），BG逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镠A；快速增長期（70～91 d），礦化加速，并在91 d時達到最大；礦化后期（91 d后），曲線先顯示平穩(wěn)然后又從105 d起出現(xiàn)下降。研究表明， 紅外成像技術(shù)有望成為骨組織工程支架材料的重要研究工具。

關(guān)鍵詞 紅外成像； 衰減全反射； 聚乳酸； 生物活性玻璃； 體外礦化

1 引 言

化學(xué)成像（Chemical imaging）與其它成像方法（如電鏡、熒光顯微鏡等）不同，主要用于觀察樣品微區(qū)域內(nèi)各化學(xué)成分的分布情況?；瘜W(xué)成像技術(shù)包括紅外成像（FTIR imaging）和拉曼成像（Raman imaging），其中紅外成像是近十幾年才發(fā)展起來的新技術(shù)，是紅外光譜技術(shù)從“點分析”向“面分析”，甚至“體分析”的重要延伸。紅外成像技術(shù)的分析模式有Mapping、Imaging [1 ]以及衰減全反射（ATR） [2 ]。對表面不太光滑的樣品，適合采用ATRFTIR mapping方式采集。該技術(shù)自問世以來已在聚合物 [3～6 ]、生命科學(xué) [7，8 ]、醫(yī)藥 [9 ]、考古和文物鑒定 [10 ]以及法醫(yī)學(xué) [11 ]等領(lǐng)域獲得應(yīng)用。

生物活性玻璃（Bioactive glass，BG）是一種骨組織工程修復(fù)材料 [12 ]，是目前唯一能促進生長因子生成、細胞繁衍、活化細胞基因表達的人工合成無機材料 [13 ]。由于其加工性差，BG通常與一些無毒的天然或合成聚合物復(fù)合制成高孔隙率的多孔支架。多孔結(jié)構(gòu)有利于骨組織培養(yǎng)中的細胞生長、增殖以及細胞外基質(zhì)的沉積、營養(yǎng)物和氧氣的進入，代謝產(chǎn)物的排出，血管和神經(jīng)的長入等 [14 ]。當(dāng)聚合物/BG復(fù)合物支架植入體內(nèi)時，BG會逐漸轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石（HA），并與骨形成緊密連接，同時聚合物逐漸降解。由于活體操作復(fù)雜，在仿生條件下進行體外礦化研究是最常用的研究手段 [15 ]，體外研究結(jié)果可對材料在體內(nèi)的活性進行較好的預(yù)測。

目前，對礦化過程的主要研究方法有掃描電鏡、X射線能譜、X射線衍射以及紅外光譜法等 [16 ]，這些方法僅能研究形貌、元素組成、總成分或總結(jié)晶狀態(tài)的變化，無法表征微區(qū)域內(nèi)化學(xué)成分的改變。本研究采用ATRFTIR mapping對礦化不同天數(shù)的聚乳酸/生物活性玻璃（PLLA/BG）支架材料表面進行紅外成像，研究了復(fù)合材料在體外礦化過程中的化學(xué)組分變化情況，并結(jié)合掃描電鏡對礦化過程的材料形貌變化進行了觀察。 2 實驗部分

2.1 儀器、材料與試劑

Nexus 8700/Continuμm XL紅外成像系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司），S4700冷場發(fā)射掃描電鏡（SEM，日本Hitachi公司），DK420S三用恒溫水箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。生物活性玻璃（美國NovaMin生物公司）；左旋聚乳酸（PLLA， η=1.22， Mw≈121000，濟南岱罡生物材料有限公司）；二氧六環(huán)、乙醇、AgNO3等試劑均為分析純。

2.2 PLLA/BG多孔復(fù)合材料的制備及體外礦化

采用溶劑澆鑄鹽瀝析法制備支架復(fù)合材料 [17 ]。簡述如下：在室溫下將3 g PLLA溶于30 mL二氧六環(huán)，并將3 g BG超聲分散于相同體積的二氧六環(huán)中；將兩種溶液混合，攪拌均勻；將已篩好的致孔劑NaCl細粉（80～100目）加入混合液中，繼續(xù)攪拌30 min；將混合液澆鑄在培養(yǎng)皿中至一定厚度，在自然條件下干燥24 h；將干燥樣片浸泡在去離子水中除去NaCl，每12 h換一次水，直至浸泡液中無殘留ClSymbolm@@ （用0.1 mol/L AgNO3溶液檢驗）；真空干燥48 h，即得到PLLA/BG多孔復(fù)合材料。

將制得的復(fù)合材料放入盛有250 mL PBS緩沖溶液（pH=7.4）的燒杯中，燒杯置于37 ℃的恒溫水浴箱進行礦化。每7天取出一部分樣品，浸泡在去離子水中除去殘留PBS，然后用濾紙除去表面水分，并于45 ℃下真空干燥24 h后備用。PBS緩沖液也同時每隔7天更換一次。

摘 要 采用衰減全反射紅外成像技術(shù)（ATRFTIR mapping）對多孔聚乳酸/生物活性玻璃（PLLA/BG）復(fù)合材料在PBS緩沖液中的礦化過程進行了研究。光譜分辨率為8 cm

Symbolm@@ 1，累加掃描8次，基于A1044/A1755的吸光度比值生成紅外圖像。成像結(jié)果表明，隨著礦化進行，材料表面產(chǎn)生的羥基磷灰石（HA）也逐漸增多，當(dāng)?shù)V化進行到84 d后，材料表面大部分已被HA覆蓋。但隨著礦化時間的繼續(xù)延長，礦化不均勻性也逐漸加劇。礦化曲線顯示礦化過程存在4個階段：礦化初期（前21 d），產(chǎn)生的HA很少；礦化增長期（21～70 d），BG逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镠A；快速增長期（70～91 d），礦化加速，并在91 d時達到最大；礦化后期（91 d后），曲線先顯示平穩(wěn)然后又從105 d起出現(xiàn)下降。研究表明， 紅外成像技術(shù)有望成為骨組織工程支架材料的重要研究工具。

關(guān)鍵詞 紅外成像； 衰減全反射； 聚乳酸； 生物活性玻璃； 體外礦化

1 引 言

化學(xué)成像（Chemical imaging）與其它成像方法（如電鏡、熒光顯微鏡等）不同，主要用于觀察樣品微區(qū)域內(nèi)各化學(xué)成分的分布情況。化學(xué)成像技術(shù)包括紅外成像（FTIR imaging）和拉曼成像（Raman imaging），其中紅外成像是近十幾年才發(fā)展起來的新技術(shù)，是紅外光譜技術(shù)從“點分析”向“面分析”，甚至“體分析”的重要延伸。紅外成像技術(shù)的分析模式有Mapping、Imaging [1 ]以及衰減全反射（ATR） [2 ]。對表面不太光滑的樣品，適合采用ATRFTIR mapping方式采集。該技術(shù)自問世以來已在聚合物 [3～6 ]、生命科學(xué) [7，8 ]、醫(yī)藥 [9 ]、考古和文物鑒定 [10 ]以及法醫(yī)學(xué) [11 ]等領(lǐng)域獲得應(yīng)用。

生物活性玻璃（Bioactive glass，BG）是一種骨組織工程修復(fù)材料 [12 ]，是目前唯一能促進生長因子生成、細胞繁衍、活化細胞基因表達的人工合成無機材料 [13 ]。由于其加工性差，BG通常與一些無毒的天然或合成聚合物復(fù)合制成高孔隙率的多孔支架。多孔結(jié)構(gòu)有利于骨組織培養(yǎng)中的細胞生長、增殖以及細胞外基質(zhì)的沉積、營養(yǎng)物和氧氣的進入，代謝產(chǎn)物的排出，血管和神經(jīng)的長入等 [14 ]。當(dāng)聚合物/BG復(fù)合物支架植入體內(nèi)時，BG會逐漸轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石（HA），并與骨形成緊密連接，同時聚合物逐漸降解。由于活體操作復(fù)雜，在仿生條件下進行體外礦化研究是最常用的研究手段 [15 ]，體外研究結(jié)果可對材料在體內(nèi)的活性進行較好的預(yù)測。

目前，對礦化過程的主要研究方法有掃描電鏡、X射線能譜、X射線衍射以及紅外光譜法等 [16 ]，這些方法僅能研究形貌、元素組成、總成分或總結(jié)晶狀態(tài)的變化，無法表征微區(qū)域內(nèi)化學(xué)成分的改變。本研究采用ATRFTIR mapping對礦化不同天數(shù)的聚乳酸/生物活性玻璃（PLLA/BG）支架材料表面進行紅外成像，研究了復(fù)合材料在體外礦化過程中的化學(xué)組分變化情況，并結(jié)合掃描電鏡對礦化過程的材料形貌變化進行了觀察。 2 實驗部分

2.1 儀器、材料與試劑

Nexus 8700/Continuμm XL紅外成像系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司），S4700冷場發(fā)射掃描電鏡（SEM，日本Hitachi公司），DK420S三用恒溫水箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。生物活性玻璃（美國NovaMin生物公司）；左旋聚乳酸（PLLA， η=1.22， Mw≈121000，濟南岱罡生物材料有限公司）；二氧六環(huán)、乙醇、AgNO3等試劑均為分析純。

2.2 PLLA/BG多孔復(fù)合材料的制備及體外礦化

采用溶劑澆鑄鹽瀝析法制備支架復(fù)合材料 [17 ]。簡述如下：在室溫下將3 g PLLA溶于30 mL二氧六環(huán)，并將3 g BG超聲分散于相同體積的二氧六環(huán)中；將兩種溶液混合，攪拌均勻；將已篩好的致孔劑NaCl細粉（80～100目）加入混合液中，繼續(xù)攪拌30 min；將混合液澆鑄在培養(yǎng)皿中至一定厚度，在自然條件下干燥24 h；將干燥樣片浸泡在去離子水中除去NaCl，每12 h換一次水，直至浸泡液中無殘留ClSymbolm@@ （用0.1 mol/L AgNO3溶液檢驗）；真空干燥48 h，即得到PLLA/BG多孔復(fù)合材料。

將制得的復(fù)合材料放入盛有250 mL PBS緩沖溶液（pH=7.4）的燒杯中，燒杯置于37 ℃的恒溫水浴箱進行礦化。每7天取出一部分樣品，浸泡在去離子水中除去殘留PBS，然后用濾紙除去表面水分，并于45 ℃下真空干燥24 h后備用。PBS緩沖液也同時每隔7天更換一次。

摘 要 采用衰減全反射紅外成像技術(shù)（ATRFTIR mapping）對多孔聚乳酸/生物活性玻璃（PLLA/BG）復(fù)合材料在PBS緩沖液中的礦化過程進行了研究。光譜分辨率為8 cm

Symbolm@@ 1，累加掃描8次，基于A1044/A1755的吸光度比值生成紅外圖像。成像結(jié)果表明，隨著礦化進行，材料表面產(chǎn)生的羥基磷灰石（HA）也逐漸增多，當(dāng)?shù)V化進行到84 d后，材料表面大部分已被HA覆蓋。但隨著礦化時間的繼續(xù)延長，礦化不均勻性也逐漸加劇。礦化曲線顯示礦化過程存在4個階段：礦化初期（前21 d），產(chǎn)生的HA很少；礦化增長期（21～70 d），BG逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镠A；快速增長期（70～91 d），礦化加速，并在91 d時達到最大；礦化后期（91 d后），曲線先顯示平穩(wěn)然后又從105 d起出現(xiàn)下降。研究表明， 紅外成像技術(shù)有望成為骨組織工程支架材料的重要研究工具。

關(guān)鍵詞 紅外成像； 衰減全反射； 聚乳酸； 生物活性玻璃； 體外礦化

1 引 言

化學(xué)成像（Chemical imaging）與其它成像方法（如電鏡、熒光顯微鏡等）不同，主要用于觀察樣品微區(qū)域內(nèi)各化學(xué)成分的分布情況?；瘜W(xué)成像技術(shù)包括紅外成像（FTIR imaging）和拉曼成像（Raman imaging），其中紅外成像是近十幾年才發(fā)展起來的新技術(shù)，是紅外光譜技術(shù)從“點分析”向“面分析”，甚至“體分析”的重要延伸。紅外成像技術(shù)的分析模式有Mapping、Imaging [1 ]以及衰減全反射（ATR） [2 ]。對表面不太光滑的樣品，適合采用ATRFTIR mapping方式采集。該技術(shù)自問世以來已在聚合物 [3～6 ]、生命科學(xué) [7，8 ]、醫(yī)藥 [9 ]、考古和文物鑒定 [10 ]以及法醫(yī)學(xué) [11 ]等領(lǐng)域獲得應(yīng)用。

生物活性玻璃（Bioactive glass，BG）是一種骨組織工程修復(fù)材料 [12 ]，是目前唯一能促進生長因子生成、細胞繁衍、活化細胞基因表達的人工合成無機材料 [13 ]。由于其加工性差，BG通常與一些無毒的天然或合成聚合物復(fù)合制成高孔隙率的多孔支架。多孔結(jié)構(gòu)有利于骨組織培養(yǎng)中的細胞生長、增殖以及細胞外基質(zhì)的沉積、營養(yǎng)物和氧氣的進入，代謝產(chǎn)物的排出，血管和神經(jīng)的長入等 [14 ]。當(dāng)聚合物/BG復(fù)合物支架植入體內(nèi)時，BG會逐漸轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石（HA），并與骨形成緊密連接，同時聚合物逐漸降解。由于活體操作復(fù)雜，在仿生條件下進行體外礦化研究是最常用的研究手段 [15 ]，體外研究結(jié)果可對材料在體內(nèi)的活性進行較好的預(yù)測。

目前，對礦化過程的主要研究方法有掃描電鏡、X射線能譜、X射線衍射以及紅外光譜法等 [16 ]，這些方法僅能研究形貌、元素組成、總成分或總結(jié)晶狀態(tài)的變化，無法表征微區(qū)域內(nèi)化學(xué)成分的改變。本研究采用ATRFTIR mapping對礦化不同天數(shù)的聚乳酸/生物活性玻璃（PLLA/BG）支架材料表面進行紅外成像，研究了復(fù)合材料在體外礦化過程中的化學(xué)組分變化情況，并結(jié)合掃描電鏡對礦化過程的材料形貌變化進行了觀察。 2 實驗部分

2.1 儀器、材料與試劑

Nexus 8700/Continuμm XL紅外成像系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司），S4700冷場發(fā)射掃描電鏡（SEM，日本Hitachi公司），DK420S三用恒溫水箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。生物活性玻璃（美國NovaMin生物公司）；左旋聚乳酸（PLLA， η=1.22， Mw≈121000，濟南岱罡生物材料有限公司）；二氧六環(huán)、乙醇、AgNO3等試劑均為分析純。

2.2 PLLA/BG多孔復(fù)合材料的制備及體外礦化

采用溶劑澆鑄鹽瀝析法制備支架復(fù)合材料 [17 ]。簡述如下：在室溫下將3 g PLLA溶于30 mL二氧六環(huán)，并將3 g BG超聲分散于相同體積的二氧六環(huán)中；將兩種溶液混合，攪拌均勻；將已篩好的致孔劑NaCl細粉（80～100目）加入混合液中，繼續(xù)攪拌30 min；將混合液澆鑄在培養(yǎng)皿中至一定厚度，在自然條件下干燥24 h；將干燥樣片浸泡在去離子水中除去NaCl，每12 h換一次水，直至浸泡液中無殘留ClSymbolm@@ （用0.1 mol/L AgNO3溶液檢驗）；真空干燥48 h，即得到PLLA/BG多孔復(fù)合材料。

將制得的復(fù)合材料放入盛有250 mL PBS緩沖溶液（pH=7.4）的燒杯中，燒杯置于37 ℃的恒溫水浴箱進行礦化。每7天取出一部分樣品，浸泡在去離子水中除去殘留PBS，然后用濾紙除去表面水分，并于45 ℃下真空干燥24 h后備用。PBS緩沖液也同時每隔7天更換一次。