RASSF1A基因啟動子甲基化在胃癌中的檢測意義

孟凡勇，馬俊英，陳 萍

（漯河醫(yī)學高等?？茖W校第三附屬醫(yī)院普外科，河南漯河462002）

腫瘤是引起目前人類死亡的主要原因，其中胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來隨著生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加、發(fā)病年齡趨向年輕化的趨勢［1］。胃癌發(fā)生、發(fā)展經(jīng)歷了由量變到質(zhì)變、漸變到突變的連續(xù)發(fā)展過程，期間涉及到癌基因的激活或者抑癌基因的失活，表觀遺傳學修飾可以調(diào)控基因的表達，DNA甲基化是一種基因主要的表觀遺傳學修飾形式［2］，近期的研究顯示抑癌基因啟動子的過度甲基化是抑癌基因失活的一個重要機制，Ras 相關(guān)結(jié)構(gòu)域家 族 基 因1A （ras associated domain family gene 1A，RASSF1A）是近年來已經(jīng)確認的一個抑癌基因，本研究檢測了胃癌患者RASSF1A基因啟動子甲基化的情況，以探討其與胃癌的關(guān)系，以期為胃癌的早期預(yù)防及分子靶向治療提供更多的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集漯河醫(yī)學高等?？茖W校第一、第二、第三附屬醫(yī)院2003年2月至2013年10月保存的200例胃癌患者的胃癌組織蠟塊，其中，男124例，女76例，年齡41～77 歲，平均（64.2±12.3）歲，所有病例均經(jīng)病理確診為胃腺癌，均行胃癌根治術(shù)。另取30例胃潰瘍切除患者的正常胃壁組織作為對照，所有病例均經(jīng)病理確診未見腫瘤組織，其中，男19例，女11例，年齡39～76 歲，平均（63.1±11.8）歲。兩組患者在性別、年齡、臨床資料方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 組織蠟塊DNA提取試劑盒購自美國基因公司，DNA甲基化修飾試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，RASSF1A基因啟動子甲基化檢測引物和甲基化特異性PCR（MSP-PCR）反應(yīng)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖購自上?？道锟萍技夹g(shù)有限公司。9700 PCR儀購自美國ABI 公司，電泳槽購自北京六一儀器廠。

1.2.2 RASSF1A基因啟動子甲基化的檢測 調(diào)取石蠟包埋組織標本，嚴格按照DNA提取試劑盒的說明書操作提取各個標本的基因組DNA，DNA甲基化修飾試劑盒對基因組1μg DNA進行亞硫酸鹽修飾，使用甲基化以及非甲基化引物進行MSP-PCR反 應(yīng)，RASSF1A甲基化引物，正向：5′-GGG TIT TGC GAG AGC GCG-3′，反向：5′-GCT AAC AAA CGC GAA CCG-3′；RASSF1A非甲基化引物，正向：5′-GGT TTT GTG AGA GTG TGT TTA G-3′，反向：5′-CAC TAA CAA ACA CAA ACC AAA C-3′。MSP-PCR反應(yīng)體系為25μL，MSPPCR反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃60 s，65 ℃30 s，72℃30 s，擴增35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。RASSF1A基因擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果判讀：甲基化引物未見條帶、非甲基化引物見條帶為未甲基化，其余為甲基化，甲基化陽性率（%）＝（甲基化陽性數(shù)／總例數(shù)）×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌RASSF1A基因啟動子的甲基化變化 胃癌患者200例癌組織中檢測到74例RASSF1A基因啟動子甲基化，陽性率為37.0%；對照患者30例正常胃壁組織中檢測到4例RASSF1A基因啟動子甲基化，陽性率為13.3%，RASSF1A基因啟動子甲基化陽性率在胃癌組織顯著高于正常胃壁組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 RASSF1A基因啟動子甲基化的MSP-PCR 檢測

2.2 胃癌患者RASSF1A基因啟動子甲基化變化與臨床指標的相關(guān)性分析 將胃癌患者根據(jù)腫瘤臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度進行分組，結(jié)果顯示胃癌患者RASSF1A基因啟動子甲基化陽性率在臨床Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和中、低分化的患者分別為46.2%、47.7%和48.7%，顯著高于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高分化患者的27.1%、28.6%和29.8%（P＜0.05）。見表1。

表1 胃癌患者RASSF1A基因啟動子甲基化變化與臨床指標的相關(guān)性分析

2.3 患者隨訪情況 術(shù)后隨訪1年，74例RASSF1A基因啟動子甲基化胃癌患者復(fù)發(fā)12例，復(fù)發(fā)率為16.2%，對照患者復(fù)發(fā)7例，復(fù)發(fā)率為5.6%，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

表觀遺傳學是指細胞分裂增殖過程中DNA序列不改變，但一系列的DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等的參與，影響相關(guān)基因表達的一門學科［3-5］。其中，DNA甲基化作為表觀遺傳學中的一個重要內(nèi)容最受重視，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、預(yù)后評估的價值已經(jīng)得到了證實［6-7］。DNA甲基化機制是S-腺苷甲硫氨酸上的活性甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下的化學修飾過程，轉(zhuǎn)移至胞嘧啶的第5 位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶，因此可以設(shè)計特異性的引物區(qū)分出甲基化的狀態(tài)［8-9］，使用甲基化的特異性引物。本研究發(fā)現(xiàn)了胃癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化的陽性率顯著高于對照正常胃壁組織，說明RASSF1A基因啟動子甲基化參與了胃癌的致病過程。RASSF1A基因是一個抑癌基因，可以通過多種途徑抑制細胞生長和促進細胞凋亡，例如其可以阻斷JNK通路，下調(diào)細胞周期素1 等抑制腫瘤細胞的生長，DNA甲基化在調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)和基因表達方面發(fā)揮著重要作用，抑癌基因啟動子Cp G島的甲基化，可以失活相應(yīng)基因的表達［10-13］。由此可以間接推斷出RASSF1A基因啟動子甲基化可以失活RASSF1A基因，參與胃癌的發(fā)生過程。

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，本研究觀察到胃癌患者RASSF1A基因啟動子甲基化陽性率在臨床Ⅲ、Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和中、低分化的患者顯著高于臨床Ⅰ、Ⅱ期，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高分化的患者。得出RASSF1A基因啟動子甲基化可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過程。

綜上所述，本研究顯示胃癌組織中RASSF1A基因啟動子甲基化，可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程，并有可能作為胃癌分級、預(yù)后評估的新指標。由于本研究未檢測RASSF1A基因的表達情況，其啟動子甲基化是否真正影響基因表達尚無直接的證據(jù)，具體的調(diào)控機制還有待進一步的研究證明。此外，DNA甲基化是一種可逆的變化，目前，已有5-氮雜脫氧胞苷（5-Aza-Cd R）去甲基化處理治療惡性腫瘤的報道［14-15］，針對RASSF1A基因啟動子的去甲基化治療，有可能成為胃癌的一個潛在治療靶點，相關(guān)方面的研究將會對腫瘤的治療和預(yù)后發(fā)揮積極的作用。

［1］ Qu Y，Dang S，Hou P.Gene methylation in gastric cancer［J］.Clinica Chimica Acta，2013（424）：53-65.

［2］ 陸俊駿，錢燁，連強.胃癌遺傳學及表遺傳學研究進展［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（19）：43-46.

［3］ Guo W，Dong Z，Chen Z，et al.Aberrant Cp G island hypermethylation of RASSF1A in gastric cardia adenocarcinoma［J］.Cancer Invest，2009，27（4）：459-465.

［4］ Jung HY，Jung JS，Whang YM，et al.RASSF1A suppresses cell migration through inactivation of HDAC6 and increase of acetylated α-Tubulin［J］.Cancer Res Treat，2013，45（2）：134-144.

［5］ 王玉新，張文霞.DNA甲基化和腫瘤［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23（3）：786-792.

［6］ Shi DT，Han M，Gao N，et al.Association of RASSF1A promoter methylation with gastric cancer risk：a meta-analysis［J］.Tumour Biol，2014，35（2）：943-948.

［7］ Fu L，Zhang S.RASSF1A promotes apoptosis and suppresses the proliferation of ovarian cancer cells［J］.Int J Mol Med，2014，33（5）：1153-1160.

［8］ Yang Q，Shao Y，Shi J，et al.Concomitant PIK3CA amplification and RASSF1A or PAX6 hypermethylation predict worse survival in gastric cancer［J］.Clin Biochem，2014，47（1／2）：111-116.

［9］ 賀永剛，劉昕，趙超.去甲基化在胃癌治療中研究進展［J］.中華實用診斷與治療雜志，2013，27（8）：733-735.

［10］ 宋傳貴，劉星，黃昌明，等.MMP-1 基因1G／2G多態(tài)性與胃癌預(yù)后相關(guān)性的探討［J］.中華腫瘤防治雜志，2011，18（11）：833-835.

［11］ 殷霞麗，謝麗，魏嘉，等.COX-2 單核苷酸多態(tài)性與胃癌生物學行為相關(guān)性研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2010，18（11）：2192-2195.

［12］ Yuan T，Deng S，Chen M，et al.Association of DNA repair gene XRCC1 and XPD polymorphisms with genetic susceptibility to gastric cancer in a Chinese population［J］.Cancer Epidemiol，2011，35（2）：170-174.

［13］ Hou Z，Yin H，Chen C，et al.microRNA-146a targets the L1 cell adhesion molecule and suppresses the metastatic potential of gastric cancer［J］.Mol Med Rep，2012，6（3）：501-506.

［14］ Tang Y，Gao XD，Wang Y，et al.Widespread existence of cytosine methylation in yeast DNA measured by gas chromatography／mass spectrometry［J］.Anal Chem，2012，84（16）：7249-7255.

［15］ Chen ZX，Riggs AD.DNA methylation and demethylation in mammals［J］.J Biol Chem，2011，286（21）：18347-18353.