朱亞新，陳朝銀，*，趙聲蘭

（1.昆明理工大學(xué)，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明 650500）

核桃多酚對酪氨酸酶的作用

朱亞新1，陳朝銀1，*，趙聲蘭2

（1.昆明理工大學(xué)，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南昆明 650500）

核桃多酚主要含黃酮類和酚酸類化合物，它們不僅能通過干擾酪氨酸酶活性而影響黑色素合成及黃褐斑的形成，也有很好的抗紫外線、抗氧化、清除自由基等功效，是一種很有潛力的天然護膚因子。本文就核桃多酚對酪氨酸酶的作用作一綜述，為綜合利用核桃資源開發(fā)天然植物祛斑產(chǎn)品提供參考。

核桃，多酚，酪氨酸酶

黃褐斑是一種極為廣泛的獲得性面部色素代謝異常對稱性皮膚病，一般對稱分布在額部、顴頰部、鼻旁、眼和口唇周圍[1]。遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)、紫外線照射、避孕藥、化妝品等是引起黃褐斑的主要因素[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為黃褐斑主要是由黑色素在皮膚內(nèi)增多引起的，黑色素細胞增多和黑色素生成增多是黑色素增多的兩個主要因素[3]，因而可通過阻斷黑色素合成來減少黃褐斑。目前祛斑產(chǎn)品中常添加氧化亞油酸、重金屬、防腐劑、香料等，這些物質(zhì)不僅對皮膚有很強的刺激性，甚至會引起過敏反應(yīng)[4]。SFDA批準的千白氫醌乳膏，主治黃褐斑、雀斑術(shù)后色素沉著，但其主要成分氫醌對皮膚有一定刺激性，長期使用會導(dǎo)致嚴重的外源性褐黃病[5]。核桃富含多酚化合物，有很好的抗紫外線、抗氧化、清除自由基等功效[6]，有的多酚化合物作為酪氨酸酶的底物類似物與游離酶結(jié)合，抑制黑色素生成，祛除黃褐斑，是良好的祛斑化妝品原料[7]。然而，從核桃不同浸提物中分離純化某些特定結(jié)構(gòu)的多酚難度較大，且得率較低。本文主要闡述核桃相關(guān)多酚對酪氨酸酶的作用，以尋求對抑制黑色素生成最有效的核桃多酚，為進一步利用豐富的核桃資源開發(fā)新一代天然祛斑產(chǎn)品提供一定參考。

1 黑色素的產(chǎn)生及抑制機理

黑色素是引起黃褐斑的主要原因之一，它由皮膚表皮基底層的黑色素細胞產(chǎn)生[8]。在黑色素細胞內(nèi)，酪氨酸在酪氨酸酶作用下逐漸被氧化為多巴和多巴醌，經(jīng)重排與一系列代謝過程聚合為5，6-二羥基吲哚、吲哚醌，最終形成黑色素[9]。色素沉著及局部皮膚過黑正是由于黑色素分布不均或增長過快造成的[10]。

在產(chǎn)生黑色素的整個反應(yīng)過程中，酪氨酸酶既可以作為酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶，又可以作為5，6-二羥基吲哚氧化酶，是黑色素形成過程中的主要限速酶[11]，其活性與黃褐斑的形成正相關(guān)[12]。通過抑制酪氨酸酶的活性可阻斷黑色素合成，從而達到去除黃褐斑的作用。皮膚黑色素的抑制主要包括黑色素細胞的胞內(nèi)抑制和胞外抑制，對酪氨酸酶的抑制屬于胞內(nèi)抑制，根據(jù)抑制機理的不同，又可分為酪氨酸酶的非破壞型抑制和破壞型抑制[13]。前者是通過抑制酪氨酸酶的合成或取代酪氨酸酶的作用底物來阻斷黑色素的形成，而后者則由抑制劑直接對酪氨酸酶進行修飾和改性[14]。多酚化合物主要作為酪氨酸酶的底物類似物與游離酶結(jié)合，抑制黑色素生成，達到祛斑功效[15]。

2 多酚對酪氨酸酶作用的測定方法

多 酚 化 合 物 對 酪 氨 酸 酶 有 激 活 或 抑 制 作 用[16]，如高良姜總黃酮在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進酪氨酸酶 活 性 和 黑 色 素 合 成[17]；夏 枯 草 黃 酮 能 很 好 地 增 強酪氨酸酶的疏水性，是酪氨酸酶的競爭型抑制劑[18]；花生紅衣總多酚對酪氨酸酶有一定的抑制作用，且最高抑制率可達89.65%[19]。通過對多酚化合物與酪氨酸酶作用的研究，可以找到酪氨酸酶的多酚抑制劑，將它們作為祛斑因子添加于化妝品中可以開發(fā)出天然無副作用的祛斑產(chǎn)品。多酚對酪氨酸酶的作用一般可由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求得酪氨酸酶催化L-DOPA氧化的米氏常數(shù)Km和最大速度Vm，并根據(jù)曲線判斷多酚單體的抑制作用類型，求出多酚單體對酪氨酸酶游離酶的抑制常數(shù)（KI）及其對酪氨酸酶與底物絡(luò)合物的抑制常數(shù)（KIS）[16，20]。也可以運用分子模擬軟件對抑制劑與酪氨酸酶的相互作用進行分子對接，推斷作用機制，并通過分子動力學(xué)模擬進行驗證以確定抑制作用類型[21]。酶抑制劑的抑制作用類型見表1。

3 核桃相關(guān)多酚化合物及其對酪氨酸酶的作用

核桃仁種皮中含有豐富的黃酮類及酚酸類多酚化合物，黃酮類中以蘆丁含量最高，酚酸類中則以沒食子酸含量最高[22]。萬政敏等[23]采用Sephadex-20分離核桃青皮中多酚，并通過HPLC鑒定為沒食子酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、咖啡酸、綠原酸、蘆丁、槲皮素、桑色素；劉傳水等[24]通過經(jīng)典色譜方法對核桃種皮中化合物進行分離并采用光譜分析等方法進行鑒定，確定了化合物為紅景天苷、長壽花糖苷、沒食子酸等；孟阿會[25]通過高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對核桃油進行分析鑒定獲得包括槲皮素、沒食子酸、咖 啡 酸、鞣花酸等在 內(nèi) 的11 種 物質(zhì) ；Zhang Z等[26]也通過對核桃仁中物質(zhì)的分離鑒定，檢測到了香草酸、鄰苯三酚、兒茶素等，見表2。

目前已研究發(fā)現(xiàn)對酪氨酸酶有激活作用的核桃相關(guān)多酚有酚酸類的綠原酸、阿魏酸、咖啡酸；有抑制作用的有酚酸類的香草酸、沒食子酸、對羥基苯甲酸和黃酮類的兒茶素、蘆丁、槲皮素、桑色素、鞣花酸、紅景天苷等（見表2）；酚酸類的鄰苯三酚和黃酮類的長壽花糖苷對酪氨酸酶的作用尚未見報道。

核桃相關(guān)多酚單體有很好的抗氧化、抗紫外線、清除自由基、抗衰老、祛斑保濕等作用，能夠很好地清除皮膚中的自由基，保護組織免受氧化傷害，防止衰老[33]。多酚單體與蛋白質(zhì)以疏水鍵和氫鍵方式發(fā)生復(fù)合反應(yīng)，能使皮膚產(chǎn)生收斂，從而呈現(xiàn)出細膩緊致的狀態(tài)。此外，多酚作為酪氨酸酶的底物類似物與游離酶結(jié)合，抑制黑色素生成，是化妝品中很好的祛斑護膚因子[7]。

4 核桃相關(guān)多酚對酪氨酸酶作用機理

通過核桃相關(guān)多酚對酪氨酸酶作用機理的研究有利于尋找更為高效的黑色素抑制劑。Xie等[27]研究表明：槲皮素、高良姜精、非瑟酮、3，7，4’-三羥基黃酮和桑色素這些黃酮醇類化合物均是酪氨酸酶的競爭性抑制劑，其中槲皮素的IC50值約為0.05mmol/L，抑 制 常 數(shù)（KI）為 0.029mmol/L，桑 色 素 的 IC50值 為0.72mmol/L，KI值為0.41mmol/L。由于槲皮素和桑色素的B環(huán)取代基不同，桑色素3-和2’-羥基之間形成的分子內(nèi)氫鍵影響了4-羰基和 3-羥基與酶活性中心的銅形成螯合構(gòu)象，所以桑色素對酪氨酸酶的抑制活性遠低于槲皮素。宋康康等[15]通過研究抑制劑對酪氨酸酶的作用，測得對羥基苯甲酸的IC50值為1.30mmol/L，抑制常數(shù)（KI）為0.73mmol/L。Peng L H等[34]發(fā) 現(xiàn) 紅 景 天 苷 對 酪 氨 酸 酶 具 有 抑 制 作 用 ，但 未測定其IC50值和抑制常數(shù)（KI）。

Si Y X等[21]應(yīng)用模擬對接并通過分子動力學(xué)模擬進行驗證以確定蘆丁與酪氨酸酶之間的作用關(guān)系，實驗測得蘆丁對酪氨酸酶抑制的IC50值為6.8mmol/L，且抑制作用表現(xiàn)為競爭型抑制，抑制常數(shù)（KI）為1.10mmol/L。邱龍新等[35]采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法發(fā)現(xiàn)沒食子酸對酪氨酸酶具有競爭性抑制 作 用 ，且IC50值 為 0.076mmol/L，抑 制 常 數(shù)（KI）為0.0868mmol/L。這是由于沒食子酸分子中含有與多巴的分子結(jié)構(gòu)相似的多酚基成分，它們與底物競爭酶，導(dǎo)致酶活力下降。Zhang Z等[26]也從核桃仁中分離并檢測到具有抗氧化活性的兒茶素。曾亮等[28]采用酶動力學(xué)方法研究了兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的抑制效應(yīng)，測得兒茶素對馬鈴薯酪氨酸酶的IC50值約為0.88mmol/L，且抑制作用表現(xiàn)為競爭型抑制，抑制常數(shù)（KI）為0.52mmol/L。

表1 酶抑制劑的抑制作用類型Table 1 Types of inhibition by enzymes

表2 核桃多酚單體及其相關(guān)生理功能和對酪氨酸酶的抑制作用Table 2 Polyphenols isolated and identified from walnuts and the inhibition to tyrosinase

核桃油具有很好的清除自由基、抗氧化作用，孟阿會[25]通過高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法從核桃油中檢測出一定量的鞣花酸。鞣花酸對酪氨酸酶抑制活性是通過測定酪氨酸酶催化酪氨酸生成的多巴色素的量得到的，因為在475nm波長下多巴色素有最大吸收峰。方燕玉等[29]測得鞣花酸對酪氨酸酶的IC50值為0.165mmol/L。Yoshimasa等[30]發(fā)現(xiàn)鞣花酸對酪氨酸酶是非競爭性抑制，其抑制常數(shù)（KI）為0.0816mmol/L。鞣花酸能抗氧化、防止黑色素沉著，可制備具有良好保濕性能的化妝品。

此外，有的核桃相關(guān)多酚對酪氨酸酶有一定的激活作用。閆軍等[31]的研究結(jié)果表明，阿魏酸對酪氨酸酶具有反競爭型激活作用，咖啡酸對酪氨酸酶趨于混合型激活作用，而香草酸對酪氨酸酶具有混合型抑制作用，但未給出其抑制作用大小。龔金炎等[35]發(fā)現(xiàn)綠原酸對酪氨酸酶具有一定的激活作用。

5 結(jié)論與展望

植物多酚具有良好的抗紫外線、抗氧化、清除自由基、祛斑保濕功效，且對皮膚和粘膜無刺激和過敏性反應(yīng)的特性使其在護膚品領(lǐng)域占有越來越重要的地位[6]。法國蘭蔻化妝品推出的復(fù)合植物異黃 酮 活 力 系 列 品 牌 產(chǎn) 品 獲 得 了 很 好 的 口 碑[36]；瑞 士Cosmetochem AG公司研發(fā)的以類黃酮為基本原料的Citrolumine具有祛斑、護膚作用[37]。核桃多酚化合物作為酪氨酸酶的底物類似物與游離酶結(jié)合，抑制黑色素生成，祛除黃褐斑，且槲皮素、沒食子酸、鞣花酸等在較低濃度下就能對酪氨酸酶產(chǎn)生很好的抑制作用，從而阻斷黑色素生成。核桃是世界四大干果之一，目前我國已成為世界第一大核桃生產(chǎn)國[38]，因此利用核桃多酚化合物開發(fā)新一代天然祛斑護膚產(chǎn)品，不僅能夠達到祛斑保濕效果，而且對皮膚無任何毒副作用，將會贏得更多人的喜愛。

此外，在尋求開發(fā)對皮膚作用溫和、安全可靠、效果顯著的祛斑產(chǎn)品同時，也應(yīng)當考慮產(chǎn)品本身的經(jīng)濟成本及綜合效益。雖然核桃種皮中多酚含量達20%左右[39]，但仍可通過對提取、分離方法的優(yōu)化進一步提高產(chǎn)率。對黑色素抑制作用明顯的核桃多酚單體，可利用有機合成的方法進行人工合成，不僅降低工藝難度，也能減少成本。有些核桃多酚化合物還具有抗菌消毒、抗脂質(zhì)過氧化、止咳、降血壓等功效[23]，可以結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)將這些作用最大化，以獲得一種具有高綜合效用的祛斑產(chǎn)品。

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Effect of polyphenols from walnut on tyrosinase

ZHU Ya-xin1，CHEN Chao-yin1，*，ZHAO Sheng-lan2
（1.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Faculty of Chinese Traditional Medicine，Yunnan University of Chinese Traditional Medicine，Kunming 650500，China）

Polyphenols from walnut mainly contain flavonoids and phenolics.As potential natural skin care factors，polyphenols not only could effect melanin synthesis and formation of melasma by interfering in the activity of tyrosinase ，also have good effects on anti ultraviolet radiation ，antioxidant， free radical scavenging and so on.The effects of polyphenols from walnut on tyrosinase was described，so as to provide a reference for comprehensive utilization of walnut resources to develop natural plant freckle products.

walnuts；polyphenols；tyrosinase

TS201.2

A

1002-0306（2014）22-0382-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.075

2014－01－14

朱亞新（1990-），女，碩士研究生，研究方向：生物制藥。

* 通訊作者：陳朝銀（1957-），男，博士，教授，研究方向：生物資源高效利用。

云南省科技計劃項目（2009EB081，2011AB006）；科技部支撐計劃項目（2011BAD46B00）。