張麗姣，曾 艷，張 換，張 穎，門 燕，孫媛霞,*

（1.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

海帶酶解液的戊糖片球菌發(fā)酵及其產(chǎn)物的抗氧化性、抑菌性

張麗姣1,2，曾 艷1，張 換2，張 穎1，門 燕1，孫媛霞1,*

（1.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

為探討海帶及其發(fā)酵產(chǎn)物作為功能食品的可能性，用纖維素酶水解海帶后，使用戊糖片球菌對酶解液進行發(fā)酵，并針對發(fā)酵過程中的pH值、總糖、還原糖、菌落數(shù)變化進行檢測。利用ABTS+·清除與鐵還原能力實驗測定海帶酶解物及其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性；同時借助微量熱方法，利用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌對比評價兩者的抑菌性。結(jié)果表明：37 ℃靜置培養(yǎng)下戊糖片球菌對海帶酶解液的發(fā)酵在12 h基本結(jié)束，而發(fā)酵后海帶酶解產(chǎn)物的抗氧化能力與抑菌能力分別提高了23.74%和100%。

海帶；纖維素酶水解液；戊糖片球菌；發(fā)酵；抗氧化性；抑菌性

海帶（Laminaria japonica Aresch），別名昆布、江白菜，是一種多年生大型食用褐藻，具有較高的營養(yǎng)價值和較強的保健作用。目前，我國海帶產(chǎn)量約占全球的50%，居世界首位[1]。然而，我國的海帶加工利用卻仍處于初級階段，產(chǎn)品主要是淡 干海帶、鹽漬海帶和即食調(diào)味海帶[2]。隨著海帶藥理以及有效成分研究的不斷深入，以海帶或海帶提取物為原料，開發(fā)功能性高附加值保健食品及藥物，已成為食品營養(yǎng)學(xué)者和藥學(xué)工作者的研究熱點。

乳酸菌是一類對人體有益的菌群，其在發(fā)酵過程中能生成大量的有機酸、醇類及各種氨基酸代謝物，產(chǎn)生抗腐敗菌、提高消化率、防癌等生理功效[3-4]。國內(nèi)研究者已將乳酸菌應(yīng)用于海帶發(fā)酵，研制海帶加工新型產(chǎn)品：如付容霞等[5]利用保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合菌種對海帶與脫脂乳粉進行發(fā)酵，制備發(fā)酵型海帶、黑芝麻酸奶凍；肖欣欣等[6]利用植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和短乳桿菌3 株乳酸菌制備混合乳酸菌發(fā)酵劑，用于發(fā)酵海帶，生產(chǎn)具有泡菜風(fēng)味且保留海帶鮮味的發(fā)酵制品。但這些報道存在一定的局限性：首先由于海帶細胞壁的結(jié)構(gòu)特性，如果直接對海帶進行發(fā)酵，其有效成分如褐藻多糖難以溶出，不能被菌種有效地吸收利用；其次，國內(nèi)這些報道主要關(guān)注于海帶產(chǎn)品口感，對發(fā)酵產(chǎn)品的生理功能探討甚少。而近兩年國際上已有使用乳酸菌發(fā)酵海藻生產(chǎn)功能食品的報道出現(xiàn)[7-8]。

目前對海帶有效成分提取的方法主要有熱水浸提[9-10]、有機溶劑抽提[11]與生物酶解[12-13]3 種。其中，熱水浸提耗時長、溫度高、容易造成有效成分的水解和活性降低。有機溶劑則易燃、有毒、價貴，穿透力差。與這兩者相比，生物酶解具有條件溫和、能有效保護產(chǎn)物活性，并且低能環(huán)保、易于實現(xiàn)工業(yè)化的優(yōu)點。已有研究表明纖維素酶能有效破壞海帶細胞骨架結(jié)構(gòu)，將纖維素降解為單糖，促進細胞內(nèi)活性成分溶出[14]。

在此基礎(chǔ)上，本實驗利用纖維素酶水解海帶充分釋放其有效成分后，采用戊糖片球菌對海帶酶解物進行發(fā)酵，并在發(fā)酵結(jié)束后對海帶酶解物以及其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性與抑菌性進行了對比評價，以期為利用生物酶解與生物發(fā)酵方法研發(fā)海藻功能性食品提供借鑒經(jīng)驗與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種、培養(yǎng)基與試劑

海帶由山東榮成尋山集團有限公司提供。

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）由本實驗室篩選；大腸桿菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）均由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所保藏。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉浸膏10 g、酵母粉5 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、磷酸氫二銨2 g、MgSO4?7H2O 0.58 g、MnSO4?H2O 0.25 g、吐溫-80 1 mL、去離子水1 000 mL；待培養(yǎng)基完全溶解，調(diào)pH值至6.2～6.6，121 ℃濕熱滅菌20 min。葡萄糖終質(zhì)量濃度為2 g/100 mL，為防止葡萄糖高溫滅菌時發(fā)生炭化，配制培養(yǎng)基時，單獨將其配制成20 g/100 mL的糖溶液，115 ℃濕熱滅菌20 min。最后將兩者混合即為本實驗所用的MRS培養(yǎng)基。

纖維素酶Cellulase ACCF-4740 日本明治制果藥業(yè)株式會社；2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnicacid）diammonium salt，ABTS）、Trolox、鐵氰化鉀、過硫酸鉀 美國Sigma-Aldrich公司；三氯乙酸、三氯化鐵美國Alfa Aesar公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；80目篩 浙江上虞市五星沖壓篩具廠；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；FE20實驗室pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；D-37520離心機美國Thermo公司；IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、IKA HB10數(shù)顯/控制加熱鍋 廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；SHZ-D（Ⅱ）循環(huán)水式真空泵 河南省予華儀器有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TAM Ⅲ熱活性微量熱儀 美國TA儀器；手動固相微萃取進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維美國Supelco公司；Agilent 6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS彈性毛細管柱 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 海帶酶解液及酶解物的制備

參考張換等[14]的方法稍作調(diào)整進行。設(shè)定條件為料液比1∶40（m/V）、纖維素酶Cellulase ACCF-4740添加量1%、溫度45 ℃、pH 4.0、反應(yīng)時間2 h。纖維素酶水解結(jié)束后，沸水浴滅酶15 min，12 000 r/min離心，收集上清液得到海帶纖維素酶水解液，將其冷凍干燥，得到海帶酶解物，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 戊糖片球菌發(fā)酵海帶酶解液實驗

海帶酶解液滅酶活后，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.6，高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min），然后接種體積分數(shù)1%的MRS培養(yǎng)基活化的戊糖片球菌液到海帶酶解液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置，進行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，高壓蒸汽滅菌，12 000 r/min離心，收集上清液冷凍干燥，得到海帶發(fā)酵產(chǎn)物，于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 海帶酶解液的戊糖片球菌發(fā)酵過程中的體系參數(shù)監(jiān)控

pH值測定：每隔3 h于超凈臺中取樣3 mL發(fā)酵液，用pH計測定pH值。

菌落總數(shù)測定：每隔3 h于超凈臺對發(fā)酵液進行取樣，用無菌水分別稀釋至不同梯度10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，取100 μL，用涂布器均勻涂布到改良MRS固體平板培養(yǎng)基（每個稀釋梯度做3 個平行），置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。數(shù)菌落數(shù)，平板菌落數(shù)范圍以20～100 CFU為宜，乘以稀釋倍數(shù)即得到每個發(fā)酵時間點的菌落總數(shù)（CFU/mL），以菌落總數(shù)對數(shù)值表示菌的生長量。

總糖及還原糖含量測定：每隔3 h于超凈臺取樣，發(fā)酵液離心（14 000 r/min，10 min）除菌，取樣品上清液，分別采用苯酚-硫酸法[14]和DNS法測[15]定發(fā)酵液中總糖和還原糖含量。

1.3.4 抗氧化性測試

1.3.4.1 ABTS+·清除能力的測定

采用張曉溪等[16]的方法。將ABTS（7 mmol/L，5 mL）和過硫酸鉀溶液（140 mmol/L，88 μL）混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h，制備ABTS+·儲備液。用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.4）將儲備液稀釋至其在734 nm波長處吸光度為0.70±0.02備用。分別稱取一定量海帶酶解物和發(fā)酵產(chǎn)物干粉，配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，取100 μL樣品溶液，加3 mL ABTS+·溶液，于暗處反應(yīng)6 min，記錄其在734 nm波長處的吸光度A樣。以100 μL純水代替樣品，相同操作，記為A空白。按公式（1）計算ABTS+·清除率。

同時使用不同濃度的Trolox代替樣品，繪制標準曲線，計算海帶酶解物和發(fā)酵產(chǎn)物總抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）。

1.3.4.2 鐵氰化鉀還原能力的測定

采用黃海蘭等[17]的方法。分別稱取一定量海帶酶解物和發(fā)酵產(chǎn)物干粉，配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，移取1 mL待測樣品于15 mL離心管中，加入1 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 mmol/L，pH 6.6），再加入1 mL質(zhì)量分數(shù)1%的鐵氰化鉀溶液，將離心管置于50 ℃水浴20 min后，取出，加入1 mL質(zhì)量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液，750 r/min離心10 min，取1 mL離心上清液，加入1 mL純水與200 μL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的三氯化鐵溶液，振蕩均勻。以純水為參比，記錄其在700 nm波長處的吸光度A700nm。

1.3.5 海帶抑菌性研究

于超凈臺中活化各實驗菌種，將對數(shù)期菌種用LB培養(yǎng)基稀釋104倍。同時稱取一定量海帶酶解物和發(fā)酵產(chǎn)物干粉，配制成200 mg/mL的溶液（于超凈臺過無菌膜），分別移取40、80、120、160、200 μL至安瓿瓶中，無菌水補足至200 μL后，加入3.2 mL稀釋菌懸液，待測樣品最終濃度分別為0.00、2.35、4.71、7.06、9.41、11.76 mg/mL。加蓋密封，將安瓿瓶迅速放入37 ℃的微量熱儀中，跟蹤記錄菌種在待測樣品不同濃度下的熱功率（P）-時間（t）生長曲線，通過選取細菌第一指數(shù)生長期一系列的P-t點，計算菌種生長速率常數(shù)（k），根據(jù)公式（2）進一步計算出不同待測樣濃度對細菌生長的抑制率（I）[18-19]。

1.3.6 固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用色譜對揮發(fā)性成分鑒定

1.3.6.1 揮發(fā)成分萃取

用老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（250 ℃，30 min，以氦氣為流動相，老化至無干擾峰出現(xiàn)）對樣品揮發(fā)性成分進行萃取。取0.2 g海帶酶解物及發(fā)酵產(chǎn)物加入20 mL頂空瓶中，密封后于60 ℃加熱平衡10 min后，插入萃取裝置，推出纖維頭，60 ℃頂空吸附30 min，吸附后的纖維頭插入GC進樣口，250 ℃解析5 min，用于GC-MS分析。

1.3.6.2 色譜條件

色譜柱：HP-5MS彈性毛細管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；載氣：He；流速：1.3 mL/min，不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；溶劑延遲2 min。

1.3.6.3 質(zhì)譜條件

電離方式：EI離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z：33～450。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程酶解液參數(shù)變化

以海帶酶解液為培養(yǎng)基，接種食品級微生物戊糖片球菌進行發(fā)酵。發(fā)酵過程中酶解液的pH值、菌落數(shù)、總糖及還原糖含量變化見表1。戊糖片球菌發(fā)酵9 h后菌落總數(shù)達到最大值8.61（lg（CFU/mL）），發(fā)酵液pH值降至4.26，總糖含量由3.71 mg/mL降低到2.20 mg/mL，還原糖含量由2.35 mg/mL降至1.47 mg/mL。說明戊糖片球菌可以利用海帶提取液中的營養(yǎng)物質(zhì)生長，同時產(chǎn)生酸性代謝物質(zhì)，促使環(huán)境pH值隨發(fā)酵的進行逐漸降低，發(fā)酵液中總糖含量的減少主要是來自于還原糖的減少；繼續(xù)發(fā)酵至12 h，菌落總數(shù)下降，pH值變化不大，菌的生長進入衰亡期，說明戊糖片球菌對海帶酶解液的發(fā)酵在12 h已經(jīng)基本完成。

表1 發(fā)酵過程參數(shù)的變化Table1 Changes in parameters during the fermentation process

2.2 抗氧化性

2.2.1 ABTS+·清除能力

圖1 海帶酶解產(chǎn)物與發(fā)酵產(chǎn)物對ABBTTSS＋·的清除率Fig.1 ABTS radical scavening capacity of Laminaria hydrolysate and its fermented products

由圖1可知，海帶酶解物及發(fā)酵產(chǎn)物都具有清除ABTS+·能力，且對ABTS+·的清除率隨其質(zhì)量濃度增加而增大，具有質(zhì)量濃度依賴性。通過計算發(fā)現(xiàn)海帶酶解物對ABTS+·的半抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）為8.51 mg/mL，其發(fā)酵產(chǎn)物的IC50為6.49 mg/mL，相對于海帶酶解物，發(fā)酵產(chǎn)物的IC50降低了23.74%，說明乳酸菌發(fā)酵后海帶抗氧化能力提高了23.74%。這一現(xiàn)象與?or?evi?等[20]的報道一致，其利用乳酸桿菌和釀酒酵母菌發(fā)酵喬麥、麥胚、大麥和黑麥等4 種谷物，對比了發(fā)酵前后抗氧化活性的變化發(fā)現(xiàn)發(fā)酵對谷物抗氧化活性的提高起到了一定作用。此外，Li?Sha等[21]使用沸水提取海帶后測定海帶的TEAC值為6.81 ?mol/g，而本實驗中利用酶解產(chǎn)物測得的海帶TEAC值為4.95 ?mol/g。推測TEAC值的差別可能是由于不同產(chǎn)地、不同時間收獲的海帶其含有的抗氧化性物質(zhì)種類和含量不同造成的。

2.2.2 鐵氰化鉀還原力

圖2 海帶酶解物與發(fā)酵產(chǎn)物對鐵氰化鉀的還原力Fig.2 Potassium ferricyanide reducing power of Laminaria hydrolysate and its fermented products

除自由基清除外，抗氧化劑的抗氧化性還與其還原力有關(guān)，還原力越強，抗氧化性越強。由圖2可知，海帶酶解物發(fā)酵前后都具有一定鐵還原能力，且隨著其質(zhì)量濃度的增大，鐵還原能力逐漸增強。海帶發(fā)酵產(chǎn)物的鐵還原能力要優(yōu)于海帶酶解物，這一結(jié)果與兩者的ABTS+·清除能力一致。

2.3 海帶酶解物與發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌性評價

微生物生長過程中伴隨著產(chǎn)熱，產(chǎn)熱是細胞代謝的重要生理參數(shù)。微量熱法作為熱力學(xué)研究的一種重要方法，已在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。借助微量熱儀的高靈敏度，可以研究細胞的代謝過程和相關(guān)性質(zhì)。如Wang Xiaohong等[22]利用微量熱檢測考察了不同濃度乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌生長影響，通過獲得的動力學(xué)信息包括生長速率常數(shù)、抑制率和半抑制濃度，得出乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌具有抑制效果。為考察海帶酶解物與其發(fā)酵產(chǎn)物對致病菌的影響，本實驗選用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門氏菌作為研究對象，利用微量熱法研究了海帶酶解物及其發(fā)酵產(chǎn)物對上述菌群生長行為的影響。

2.3.1 大腸桿菌正常生長的熱功率-時間曲線

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長均可分為4 個時期：停滯期、第一指數(shù)生長期、第二指數(shù)生長期和衰亡期。由圖3可知，第1個峰即第一指數(shù)生長期，第2個峰即第二指數(shù)生長期。

圖3 37 ℃條件下大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中生長代謝的熱功率-時間曲線Fig.3 Thermal power-time curve of E. coli in LB medium at 37 ℃

2.3.2 海帶酶解物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌生長的影響

圖4 不同海帶酶解物質(zhì)量濃度下大腸桿菌（a）和沙門氏菌（b）在37 ℃的熱功率-時間曲線Fig.4 Thermal power-time curves of E. coli (a) and Salmonella (b) in the presence of Laminaria hydrolysate with different concentrations at 37 ℃

由圖4a可知，隨著海帶酶解物質(zhì)量濃度的增加，大腸桿菌第一指數(shù)期的最大熱功率峰值降低且出現(xiàn)時間延遲，產(chǎn)熱量也減少；第二階段的生長峰也逐漸拖后，產(chǎn)熱量減少，說明海帶提取物可抑制大腸桿菌的生長。對于沙門氏菌而言，隨海帶酶解物質(zhì)量濃度的增加，其第一指數(shù)期的最大熱功率峰值的出現(xiàn)時間與產(chǎn)熱量無明顯變化，而第二階段的生長峰逐漸提前，熱功率峰值也逐漸升高，產(chǎn)熱量隨著濃度的增大而增大（圖4b）。金黃色葡萄球菌的P-t曲線與沙門氏菌趨勢相同（圖表未給出），這表明海帶酶解物對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長具有一定的促進作用，并且這種促進作用與酶解物質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。于秀芳等[23]利用高靈敏度微量熱儀測試也發(fā)現(xiàn)人參對促進金黃色葡萄球菌代謝，卻抑制大腸桿菌、枯草桿菌生長。這是因為提取物中的蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)可為微生物的生長提供營養(yǎng)，而提取物的抑菌作用不僅與其成分組成相關(guān)，也與考察的微生物種類及數(shù)量相關(guān)。

表2 不同海帶酶解物質(zhì)量濃度下各細菌的生長速率常數(shù)（k）及其對細菌的抑制率（I）Table2 Growth rate constantk and the inhibition rate I of the bacteria in the presencee ooff Laminnaarriiaa hydrolysate with different concentrations

由表2可知，隨海帶酶解物質(zhì)量濃度的增加，大腸桿菌的第一指數(shù)期生長速率常數(shù)（k）逐漸降低，海帶酶解物對大腸桿菌的最大抑制率（I）計算為36.45%。添加不同質(zhì)量濃度的酶解產(chǎn)物，沙門氏菌與金黃色葡萄球菌的生長速率常數(shù)則沒有太大變化。穆凱峰等[11]使用圓形紙片法測試了海帶的甲醇、乙醇、丙酮提取物的抑菌性，發(fā)現(xiàn)海帶酶解物對大腸桿菌無抑制效果。徐秀麗等[24]對中國經(jīng)濟海藻甲醇浸泡提取物抑菌性的研究結(jié)果也表明，海帶酶解物對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均無抑制效果。上述有機溶劑通常用以提取揮發(fā)性、脂溶性的活性物質(zhì)，卻并不適用于水溶性活性物質(zhì)的提取，其結(jié)果只能表明海帶中揮發(fā)性、脂溶性的抑菌物質(zhì)含量甚少。盡管固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用色譜測試結(jié)果表明海帶酶解物的揮發(fā)性抑菌物質(zhì)含量少，但據(jù)前期實驗苯酚硫酸法計算其水溶性多糖含量為53.13%，而已有多篇文章報道水溶性多糖具有抑菌活性[25-26]，由此推斷可能由于大量多糖的存在，海帶酶解物才對大腸桿菌具備一定的抑菌效果。2.3.3 海帶發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌生長的影響

測定海帶發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)加入不同質(zhì)量濃度海帶發(fā)酵產(chǎn)物后，3 種菌株的生長代謝P-t曲線變化趨勢與圖4a相同，即隨著發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，菌株的第一指數(shù)期最大熱功率峰值變小且出現(xiàn)時間延遲，產(chǎn)熱量降低；第二階段的生長峰逐漸拖后，最大熱功率峰值變小，產(chǎn)熱量也隨質(zhì)量濃度的增大而減少，說明海帶發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均具有抑制效果。進一步計算得到不同質(zhì)量濃度發(fā)酵產(chǎn)物對各細菌的抑制率（I），見表3。隨發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，3 種菌的生長速率常數(shù)隨之減小，抑制率隨之增大。發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的IC50分別為7.48、8.56、9.20 mg/mL，較酶解物無法計算有效的IC50，說明發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌能力提高了將近100%，并且發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果大小為大腸桿菌＞沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌。句榮輝等[27]研究了植物乳桿菌和戊糖片球菌對金黃色葡萄球菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)這2 種乳酸菌對金黃色葡萄球菌都具有抑制效果。乳酸菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些抗細菌或真菌物質(zhì)如乙酸、乳酸、乙醇[28]和苯乳酸PLA[29]。固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析發(fā)現(xiàn)，與海帶酶解物或LB培養(yǎng)基相比，海帶酶解物的戊糖片球菌發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性物質(zhì)種類更多，含量更高（圖5）。經(jīng)NIST08質(zhì)譜庫比照鑒定，沒有在海帶酶解物中找到確定化學(xué)結(jié)構(gòu)的揮發(fā)物質(zhì)，而其戊糖片球菌發(fā)酵產(chǎn)物中卻能檢測到乙酸（保留時間9.83 min）、乙酸乙酯（9.91 min）、己酸（15.83 min）、苯乙醛（17.23 min）、乙酰胺（18.69 min）、十二烷（23.03 min）等揮發(fā)性抗菌成分[30]。盡管LB培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物含有極少量的乙酸、二甲基吡嗪（15.00 min）、鄰苯二甲酸二甲酯（29.48 min），其對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌卻無明顯抑菌作用。由此推斷發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌性提高，是由戊糖片球菌利用海帶酶解液進行生長代謝時生成的產(chǎn)物引起的，而戊糖片球菌本身的抑菌性有限。

表3 不同海帶發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度下各細菌的生長速率常數(shù)（k）與其對細菌的抑制率（I）Table3 Growth rate constantk and the inhibition rateI of the bacteria in the presence of fermentedLaminnaarriiaa hydrolysate with different concentrattiioonnss

圖5 海帶酶解物（a）、LB培養(yǎng)基戊糖片球菌發(fā)酵產(chǎn)物（b）與海帶酶解物的戊糖片球菌發(fā)酵產(chǎn)物（c）總離子流圖Fig.5 Total ion current chromatogram of Laminaria hydrolysate (a), and fermented products from LB medium (b) and from the hydrolysate (c)

3 結(jié) 論

海帶酶解物具有抗氧化性，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱經(jīng)戊糖片球菌靜置發(fā)酵12 h后，其發(fā)酵產(chǎn)物對ABTS+·清除效果更為明顯，提高了23.74%，說明戊糖片球菌發(fā)酵能增加海帶酶解物的抗氧化能力。海帶酶解物對大腸桿菌具有有限的抑制生長作用，然而經(jīng)戊糖片球菌發(fā)酵后，其發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌都顯示了良好的生長抑制效果。上述結(jié)果表明益生菌戊糖片球菌發(fā)酵能顯著提高海帶酶解物的抗氧化性和抑菌性，生物酶解與生物發(fā)酵方法的結(jié)合在功能性海藻食品研發(fā)應(yīng)用上極具潛力。

[1] 王文亮, 王守經(jīng), 宋康, 等. 中國海帶資源的功能及其開發(fā)利用研究[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù): 農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè), 2008(11): 40-41.

[2] 程艷, 陳麗嬌, 肖欣欣, 等. 國內(nèi)外海帶加工現(xiàn)狀與福建省的發(fā)展對策[J]. 福建水產(chǎn), 2011, 32(2): 89-92.

[3] 云月英, 王云龍. 乳酸菌與健康[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2009(1): 67-70.

[4] 余煥玲, 晏萍. 乳酸菌的生理功能及在食品中應(yīng)用[J]. 飲料工業(yè), 2000, 3(4): 10-13.

[5] 付榮霞, 楊樹成, 趙婧博. 發(fā)酵型海帶、黑芝麻酸奶凍的研究[J]. 中國乳品工業(yè), 2010, 38(4): 26-28.

[6] 肖欣欣. 海帶乳酸發(fā)酵制品的研制及貯藏期間菌相變化的研究[D].福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2012: 22-35.

[7] LEE B J. Development of functional food using fermented marineorganism[J]. Food Industry and Nutrition, 2013, 18(1): 8-12.

[8] KANG Y M, LEE B J, KIM J I, et al. Antioxidant effects of fermented sea tangle (Laminaria japonica) by Lactobacillus brevis BJ20 in individuals with high level of γ-GT: a randomized, double-blind, and placebo-controlled clinical study[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(3/4): 1166-1169.

[9] 余華. 海帶多糖提取條件的優(yōu)化和脫蛋白工藝[J]. 中國食品添加劑, 2006(3): 39-43.

[10] 劉曉林, 許加超, 高昕, 等. 海帶中主要活性成分的浸提條件[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2011, 32(6): 85-91.

[11] 穆凱峰, 吳永沛, 楊芳, 等. 海帶抗菌活性的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2009, 28(11): 559-662.

[12] 逯慎杰, 劉秀河, 田寶蘭. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化海帶提取液制備工藝的研究[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2011, 47(1): 53-56.

[13] 翟為, 張美雙, 張莉霞, 等. 復(fù)合酶法提取海帶多糖工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(18): 6-9.

[14] 張換, 曾艷, 管于平, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化海帶多糖的酶法提取工藝及其抗氧化研究[J]. 食品科技, 2013, 38(5): 197-202.

[15] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K. Colorimetric method for determination of sugara and related substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350-356.

[16] 張曉溪, 曾艷, 張澤生, 等. 果糖與氨基酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2011, 32(6): 175-178.

[17] 黃海蘭, 徐波, 李增新, 等. 嶗山蘑菇抗氧化成分提取及其活性研究[J].食品科學(xué), 2005, 26(9): 61-66.

[18] 程丹紅, 趙艷玲, 楊宏博, 等. 微量量熱法研究左金丸與反左金丸對腸道菌群生長代謝的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2011, 31(2): 209-212.

[19] VIDHYASAGAR V, JEEVARATNAM K. Evaluation of Pediococcus pentosaceus stains isolated from Idly batter for probiotic in vitro[J]. Journal of Functional Foods, 2013, 5(1): 235-243.

[20] ?OR?EVI? T M D, ?ILER-MARINKOVI? S S, DIMITRIJEVI?BRANKOVI? S I, et al. Effect of fermentation on antioxidant properties of some cereals and pseudo cereals[J]. Food Chemistry, 2010, 119(3): 957-963.

[21] LI Sha, LI Shuke, GAN Renyou, et al. Antioxidant capacities and total phenolic contents of infusions from 223 medicinal plants[J]. Industrial Crops and Products, 2013, 51: 289-298.

[22] WANG Xiaohong, LIU Ying, XIE Bijun, et al. Effect of nisin on the growth of Staphylococcus aureus determined by a microcalorimetric method[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2005, 49(4): 350-354.

[23] 于秀芳, 張洪林, 李志萍, 等. 人參對微生物的促進和抑制代謝過程的動力學(xué)模型及其應(yīng)用的微量熱法研究[J]. 生物工程學(xué)報, 1996, 12(增刊1): 249-253.

[24] 徐秀麗, 范曉, 宋福行. 中國經(jīng)濟海藻提取物生物活性[J]. 海洋與湖沼, 2004, 35(1): 54-63.

[25] 宋小勇, 劉強, 楊磊, 等. 蒲公英多糖提取工藝及其抗菌活性研究[J].中國藥房, 2010, 21(47): 4453-4455.

[26] 趙成萍, 馮翠萍, 常曉敏. 靈芝多糖抑菌作用的研究[J]. 食用菌, 2012, 34(2): 60-61.

[27] 句榮輝, 黃廣學(xué), 羅紅霞, 等. 植物乳桿菌、戊糖片球菌對產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌生長的影響[J]. 肉類研究, 2013, 27(7): 6-9.

[28] PRACHYAKIJ P, CHARERNJIRATRAKUL W, KANTACHOTE D. Improvement in the quality of a fermented seaweed beverage using an antiyeast starter of Lactobacillus plantarum DW3 and partial sterilization[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(9): 1713-1720.

[29] 郁書懷. 片球菌屬乳酸菌乳酸脫氫酶生物合成苯乳酸的研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2013: 1-3.

[30] 許傳坤, 莫明和, 張克勤. 固相微萃取-氣質(zhì)法測定土壤揮發(fā)性抑菌物質(zhì)[J]. 微生物學(xué)報, 2004, 31(5): 14-18.

Antioxidant and Antibacterial Activities of Enzymatic Hydrolysate of Laminaria japonica Aresch and Its Fermented Products by Pediococcus pentosaceus

ZHANG Li-jiao1,2, ZENG Yan1, ZHANG Huan2, ZHANG Ying1, MEN Yan1, SUN Yuan-xia1,*
(1. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China; 2. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The present study was designed to explore the possible application of Laminaria japonica Aresch in functional foods. Laminaria was hydrolyzed with cellulase and then the hydrolysate was fermented with Pediococcus pentosaceus. The changes in pH, total sugar, reducing sugar and total bacterial count during the fermentation process were monitored. The antioxidant activity of the hydrolysate and its fermented products was evaluated by ABTS radical scavenging capacity and ferric ion reducing power. Furthermore, their antibacterial activity was determined by microcalorimetry against E. coli, Staphylococcus aureus and Salm onella. The results showed that when incubated at 37 ℃, the fermentation of the enzymatic hydrosate by Pediococcus pentosaceus could be completed in 12 h. Compared to this hydrolysate, the antioxidant and antibacterial activity of the fermented products were increased by 23.74% and 100%, respectively.

Laminaria japonica Aresch; cellulase hydrolysate; Pediococcus pentosaceus; fermentation; antioxidant activity; antibacterial activity

TS254.4

A

1002-6630（2014）21-0164-06

10.7506/spkx1002-6630-201421032

2014-06-13

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102105）；天津市科技計劃項目（12ZCZDSY14900）

張麗姣（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然活性物質(zhì)。E-mail：zhang_lj@tib.cas.cn

*通信作者：孫媛霞（1963—），女，研究員，博士，研究方向為功能糖與天然活性物質(zhì)。E-mail：syx0430@hotmail.com