范小龍，董華強(qiáng)，張英慧,*，劉 欣,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品與園藝 學(xué)院，廣東 佛山 528231）

多穗柯三葉苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用

范小龍1，董華強(qiáng)2，張英慧2,*，劉 欣1,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品與園藝 學(xué)院，廣東 佛山 528231）

探討多穗柯三葉苷對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)的抗炎癥作用。以3、30、300 mg/（kg·d）3 個(gè)劑量組的多穗柯三葉苷灌胃小鼠3 d后，腹腔注射0.1 mg/kg LPS，觀察三葉苷預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響。酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)定小鼠血清中 炎癥因子腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的含量，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)肝組織中TNF-α和IL-6的mRNA水平，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠肝組織中TNF-α和IL-6蛋白水平。結(jié)果表明，3 mg/（kg·d）三葉苷劑量組可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠血清中TNF-α和IL-6的分泌，降低肝組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。多穗柯三葉苷對(duì)小鼠的炎癥反應(yīng)具有一定的保護(hù)作用。

多穗柯；三葉苷；抗炎作用；脂多糖；炎癥反應(yīng)

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成成分，同時(shí)也是這些細(xì)菌引發(fā)炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)[1]。LPS通過(guò)其與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的Toll樣受體（TLR）4/CD14復(fù)合體的結(jié)合[2]，激活細(xì)胞信號(hào) 通路從而引發(fā)炎癥因子的過(guò)量表達(dá)，包括腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）[3-5]。細(xì)胞炎癥因子的過(guò)量分泌會(huì)引起全身炎癥反應(yīng)綜合征、組織損傷、代謝綜合征等疾病，甚至導(dǎo)致死亡。降低TNF-α、IL-6等因子的表達(dá)是預(yù)防機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要措施。

多穗柯（Lithocarpus polystachyus Rehd）為殼斗科柯屬植物，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)，其嫩葉中富含植物化學(xué)活性成分[6-8]。本課題組從多穗柯的嫩葉中分離出一種甜度較高的二氫查耳酮——三葉苷（根皮素-4’-β-D-葡萄糖苷，結(jié)構(gòu)如圖1所示），前期研究表明三葉苷對(duì)糖尿病關(guān)鍵酶（α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶）活性有明顯的抑制作用[9]。相關(guān)研究證實(shí)三葉苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性[10-11]。目前尚未見對(duì)其潛在抗炎癥作用的研究。本實(shí)驗(yàn) 旨在研究多穗柯三葉苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥因子表達(dá)的影響。

圖1 三葉苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of trilobatin

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)BALB/c雌鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

三葉苷（純度＞99%），分離純化自多穗柯嫩葉[9]。

LPS（E.coli O26:B6） 美國(guó)Sigma公司；小鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒、小鼠IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒 上海依科賽生物制品有限公司；RNAiso Plus試劑 日本TaKaRa公司；M-MLV First Strand Kit 美國(guó)Invitrogen公司；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 日本Toyobo公司；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 上海英濰捷基公司；TNF-α抗體、IL-6抗體 美國(guó)Santa Cruz公司；免疫組化染色試劑盒 武漢博士德公司。

1.2 儀器與設(shè)備

核酸蛋白檢測(cè)儀、高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SpectraMax M2型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)MDC公司；Stat-Fax 2600型自動(dòng)洗板機(jī) 美國(guó)Awareness公司；梯度PCR儀 德國(guó)Biometra公司；7500型熒光定量PCR儀 美國(guó)Applied Biosyst ems公司；光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立

采用小劑量LPS注射的方法建立炎癥反應(yīng)小鼠模型[12]。LPS模型對(duì)照組和三葉苷各劑量組小鼠腹腔注射（按體質(zhì)量計(jì)，下同）0. 1 mg/kg LPS[13]，空白對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。腹腔注射后0、2、4、8 h，摘除眼球采血，分離血清，測(cè)定血清中TNF-α和IL-6的含量。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

60 只BALB/c雌鼠隨 機(jī)分為5 組，每組12 只，分別為空白對(duì)照組，LPS模型對(duì)照組，三葉苷低、中、高劑量組分別以3、30、300 mg/（kg·d）的劑量灌胃小鼠，連續(xù)灌胃3 d；空白對(duì)照組及LPS模型對(duì)照組灌胃等體積溶媒（0.5%羧甲基纖維素鈉）。于末次灌胃1 h后，三葉苷各劑量組和LPS模型對(duì)照組腹腔注射0.1 mg/kg LPS，空白對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。腹腔注射2 h后，摘除眼球采血，分離血清，-20 ℃保存待測(cè)。取血后立即開腹取肝組織：一部分肝組織立即用4%的多聚甲醛溶液固定，進(jìn)行免疫組化分析；剩余肝組織-80 ℃保存待測(cè)mRNA的表達(dá)變化。

1.3.3 ELISA檢測(cè)

收集各組小鼠血清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，對(duì)血清中TNF-α和IL-6進(jìn)行測(cè)定。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α和IL-6的分泌量。

1.3.4 熒光定量PCR檢測(cè)

按RNAiso Plus試劑方法提取肝組織中的總RNA，用一定量DEPC水溶解RNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完 整性，利用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)RNA溶液的濃度和純度。TNF-α和IL-6及內(nèi)參基因β-actin的mRNA擴(kuò)增采用兩步法進(jìn)行：首先利用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和隨機(jī)引物完成RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；合成的cDNA用無(wú)菌水稀釋為4 ng/μL，按表1提供的引物序列進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)采取20 μL體系，即SYBR Green Mix 10 uL，上下游引物各0.5 μL（10 μmol/L），cDNA 2 μL，三蒸水7 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 1 min； 95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。用2-ΔΔCt法分析TNF-α和IL-6 mRNA的相對(duì)含量。

表1 熒光定量PCR引物TTaabbllee 11 PPrriimmeerrss uusseedd ffoorr rreeaall--ttiimmee qquuaannttiittaattiivvee PPCCRR

1.3.5 免疫組化檢測(cè)

小鼠肝組織在多聚甲醛固定24 h，脫水后常規(guī)石蠟包埋切片，切片約4 μm厚，貼于預(yù)先涂有鉻釩明膠的載玻片上。采用免疫組化染色SABC（strept avidin-biotincomplex）法檢測(cè)在小鼠肝組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)，蘇木素細(xì)胞核復(fù)染，顯微鏡下取400×視野下觀察標(biāo)本，照相。TNF-α和IL-6陽(yáng)性染色結(jié)果為胞內(nèi)區(qū)域被部分或均勻地染上棕 紅色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥反應(yīng)模型的建立

圖2 LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥反應(yīng)模型的建立Fig.2 Establishment of animal model of LPS-induced inflammatory response

本實(shí)驗(yàn)以0.1 mg/kg的劑量腹腔注射LPS建立小鼠炎癥反應(yīng)模型。如圖2所示，空白對(duì)照組小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量在0、2、4、8 h始終保持極低水平；與空白對(duì)照組相比，LPS模型對(duì)照組小鼠腹腔注射LPS 2 h后，血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的含量顯著升高（P＜0.05），分別達(dá)到（243.63±43.07）pg/mL和（1 435.71±232.17）pg/mL，隨后其含量下降，到8 h時(shí)恢復(fù)到正常水平。

2.2 三葉苷降低LPS誘導(dǎo)的小鼠血清TNF-α和IL-6含量

表2 三葉苷對(duì)小鼠血清中TNNFF--α和IL-6分泌的影響Table2 Effect of trilobatin on the secretion of TNF-α and IL-6 in mouse serruumm

小鼠血清中的TNF-α和IL-6含量用ELISA法檢測(cè)。由表2可知，與正常對(duì)照組相比，LPS模型對(duì)照組小鼠血清中TNF-α和IL-6含量顯著升高（P＜0.05）。與LPS模型對(duì)照組相比，三葉苷低劑量組可顯著降低血清TNF-α和IL-6含量（P＜0.05），其中TNF- α為L(zhǎng)PS模型對(duì)照組的40.45%，IL-6為L(zhǎng)PS模型對(duì)照組的48.34%；三葉苷中劑量組可降低血清TNF-α的含量，但其IL-6含量與LPS模型對(duì)照組無(wú)顯著性差異；三葉苷高劑量組血清中TNF-α和IL-6含量均與LPS模型對(duì)照組無(wú)顯著性差異。

2.3 三葉苷抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)

表3 三葉苷對(duì)小鼠肝組織中TNNFF--α和IL-6 mRNA表達(dá)的影響Table3 Effect of trilobatin on TNF-α and IL-6 mRNA expression in mouse livveerr

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，LPS模型對(duì)照組小鼠肝組織中TNF-α和IL-6的mR NA表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜ 0.05）。與LPS模型對(duì)照組相比，三葉苷低、中劑量組均可降低TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；三葉苷高劑量組中TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量與LPS模型對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。三葉苷低劑量組的干預(yù)效果優(yōu)于三葉苷中劑量組，三葉苷低劑量組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量為L(zhǎng)PS模型對(duì)照組的46.78%，IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量為L(zhǎng)PS模型對(duì)照組的52.68%。

2.4 免疫組化檢測(cè)小鼠肝組織中TNF-α和IL-6的蛋白水平

圖3 小鼠肝組織TNNFF--α和IL-6表達(dá)免疫組化結(jié)果（440000×）Fig.3 Immunohistochemical examination of TNF-α and IL-6 protein expression in liver (400×)

由圖3可知，與空白對(duì)照組相比，LPS模型對(duì)照組小鼠TNF-α和IL-6在肝組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量表達(dá)，著色效果明顯。三葉苷低、中劑量組與LPS模型對(duì)照組相比，細(xì)胞核外區(qū)域染色較淺，TNF-α和IL-6的表達(dá)降低，其中三葉苷低劑量組的抑制效果優(yōu)于三葉苷中劑量組；三葉苷高劑量組與LPS模型對(duì)照組相比，TNF-α和IL-6的染色程度均無(wú)明顯差別。

3 討 論

三葉苷具有抗氧化、清除自由基的活性，是一種有一定應(yīng)用潛力的抗糖尿病活性物質(zhì)[14]。最新體外實(shí)驗(yàn)證明，根 皮素具有抗炎癥作用，可以抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、NO、前列腺素E2等炎癥因子及相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路[15]。但三葉苷是否具有潛在抗炎癥作用尚未闡明。

注射LPS到小鼠體內(nèi)能夠誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)，伴隨炎癥因子TNF-α和IL-6的大量表達(dá)[16-18]。TNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞分泌，在系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)早期大量釋放，同時(shí) 還能夠誘導(dǎo)其他炎癥因子的分泌。IL-6是一種多功能的細(xì)胞炎癥因子，是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的主要成分，在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要作用。很多植物化學(xué)物的消炎作用與降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-6表達(dá)水平有關(guān)[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)利用低劑量LPS誘導(dǎo)小鼠炎癥反應(yīng)模型，觀察多 穗柯三葉苷對(duì)LPS致小鼠炎癥反應(yīng)的抗炎作用。結(jié)果表明，3 mg/（kg·d）劑量三葉苷可顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的血清中TNF-α和IL-6含量的升高及其在肝組織中mRNA表達(dá)水平。同時(shí)，免疫組化結(jié)果可知三葉苷低劑量組的小鼠肝細(xì)胞中TNF-α和IL-6的蛋白水平明顯降低。根據(jù)以上結(jié)果，推測(cè)三葉苷具有減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的作用，三葉苷的保護(hù)作用可能是通過(guò)下調(diào)炎癥因子TNF-α和IL-6的mRNA表 達(dá)水平，進(jìn)而抑制其分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的。多穗柯三葉苷抑制炎癥因子分泌的研究可為甜茶多穗柯的綜合利用和功能性食品的研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

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Protective Effect of Trilobatin against Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Response in Mice

FAN Xia o-long1, DONG Hua-qiang2, ZHANG Y ing-hui2,*, LIU Xin1,*
(1. College of Food Science, So uth China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. College of Food and Horticultural Sciences, Foshan University, Foshan 528231, China)

This study aimed to investigate the in vivo anti-inflammatory activity of trilobatin extracted from the young leaves of Lithocarpus polystachyus Rehd on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammatory response in mice. After being treated intragastrically with trilobatin at three different dosage s (3, 30 and 300 mg/(kg·d)) for 3 days, the mice were administered intraperitoneally with LPS (0.1 mg/kg) 1 h after the last int ragastrical treatment on day 3. The effect of trilobatin on the expression of LPS-induced pro-inflammatory cytokines was detected. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) in serum were meas ured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 in liver were assayed with real-time qu antitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The protein levels of TNF-α and IL-6 in liver were detected by immunohistochemical strept avidin-biotin complex (SABC) method. We found that trilobatin at low dosage (3 mg/(kg·d)) significantly inhibited LPS-induced TNF-α and IL-6 production in serum, and decreased their expression in liver. These results indicate that trilobatin from Lithocarpus polystachyus Rehd has protective effect on inflammatory response in mice.

Lithocarpus polystachyus Rehd; trilobatin; anti-inflammation; lipopolysaccharide (LPS); inflammatory response

TS201.4

A

1002-6630（2014）21-0186-04

10.7506/spkx1002-6630-201421036

2014-01-17

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31071537）

范小龍（1988—），男，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：kylexiao2011@163.com

*通信作者：張英慧（1974—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩c營(yíng)養(yǎng)。E-mail：zhang_ying-hui@163.com劉欣（1958—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锘瘜W(xué)及食品添加劑。E-mail：liuxin@scau.edu.cn