金 銳，曾蔚欣，楊 平，段松冷，劉俊麗，田佳懿，孫路路（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

間苯二酚是臨床常用的殺菌止癢藥物，具有一定毒性，常與苯酚、水楊酸、苯甲酸等藥物聯(lián)合制成外用洗劑，例如復(fù)方間苯二酚洗劑、復(fù)方薄荷腦洗劑、復(fù)方水楊酸擦劑等。2010年版《中國(guó)藥典》收載間苯二酚的含量測(cè)定方法為溴量法[1]，其也成為《中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范》收錄的復(fù)方間苯二酚洗劑的質(zhì)量控制方法。但該法操作煩瑣，溴滴定液因穩(wěn)定性差也較少使用，且該法最終只能得到間苯二酚與水楊酸的總量[2]，故不適合醫(yī)院制劑準(zhǔn)確、快速、高效檢驗(yàn)的要求。近幾年，雙波長(zhǎng)分光光度法、高效液相色譜法等新方法逐漸用于含間苯二酚的多組分復(fù)方制劑的含量測(cè)定與質(zhì)量控制[3-5]，并取得了良好效果。但是，此類研究大多涉及2種等比例物質(zhì)的同時(shí)測(cè)定，目前缺少針對(duì)非等比例情況的研究。本研究選擇北京市《醫(yī)療單位制劑規(guī)程》收錄的復(fù)方間苯二酚洗劑（處方組成：間苯二酚50 g、水楊酸10 g、蓖麻油50 ml，加乙醇至1 000 ml）[6]，采用雙波長(zhǎng)分光光度法，對(duì)其中的主要成分間苯二酚進(jìn)行含量測(cè)定研究，并探討非等比例情況下的一些特殊問(wèn)題。

1 材料

1.1 儀器

8453E紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)惠普公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方間苯二酚洗劑（本院制劑室，批號(hào)：20130723、20130724、20130725，含5%間苯二酚、1%水楊酸，包裝規(guī)格：每瓶30 ml，密封避光）；間苯二酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120427，分析純）；水楊酸（鎮(zhèn)江前進(jìn)化工廠，批號(hào)：121003，藥用級(jí)）；蓖麻油（湖南爾康制藥股份有限公司，批號(hào)：000220121101，藥用級(jí)）；95%乙醇為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 各組分吸收光譜的測(cè)定及波長(zhǎng)選擇

依照處方比例[間苯二酚-水楊酸（5 ∶1）]，分別精密稱取間苯二酚、水楊酸，用95%乙醇分別配制成質(zhì)量濃度為25、5 μg/ml的純標(biāo)準(zhǔn)品液；精密量取蓖麻油，依照處方組成等比例稀釋，配制含量為5%的純品液并稀釋2 000倍。在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得紫外吸收光譜圖。結(jié)果，間苯二酚在276、282 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收，水楊酸在303 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收，而蓖麻油成分則對(duì)以上波長(zhǎng)范圍內(nèi)兩者的測(cè)定影響極小。由于水楊酸在282 nm波長(zhǎng)處的吸光度值相對(duì)較大，且與320 nm波長(zhǎng)處的吸光度值形成良好的對(duì)稱關(guān)系，故選擇282 nm作為間苯二酚的測(cè)定波長(zhǎng)，選擇320 nm作為參比波長(zhǎng)。光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 紫外吸收光譜圖Tab 1 UV absorption spectrum

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取間苯二酚0.500 g、水楊酸0.100 g，置于100 ml量瓶中，加95%乙醇適量溶解，繼續(xù)加至刻度，搖勻，制成對(duì)照品初液。分別精密量取此液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 ml，置于100 ml量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，制成含間苯二酚分別為15、20、25、30、35、40 μg/ml的對(duì)照品液。依照《中國(guó)藥典》紫外-可見(jiàn)分光光度法[1]，以空白溶劑（95%乙醇）為對(duì)照，分別在282、320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算間苯二酚吸光度差值ΔA＝A282－A320。以此吸光度差值為橫坐標(biāo)（x），以間苯二酚質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)（y）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：y＝68.726 8x－2.992 9（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，間苯二酚檢測(cè)質(zhì)量濃度范圍為15～40 μg/ml。

2.3 回收率試驗(yàn)

依照處方比例，精密稱取間苯二酚0.500 g、水楊酸0.100 g，精密量取蓖麻油0.5 ml，置于100 ml量瓶中制成供試品溶液。精密量取此溶液并稀釋至間苯二酚在20～30 μg/ml范圍內(nèi)（標(biāo)準(zhǔn)含量的80%、100%和120%）。以空白溶劑為對(duì)照，分別在282、320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度差值。將吸光度差值數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

2.4 精密度試驗(yàn)

依照處方比例，精密稱取并配制間苯二酚占標(biāo)示量100%的供試品溶液，平行取6份溶液，以空白溶劑為對(duì)照，分別在282、320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算間苯二酚含量。結(jié)果顯示，間苯二酚含量變化很小，RSD＝0.46%（n＝6）。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

依照處方比例，精密稱取并分別配制間苯二酚占標(biāo)示量80%、100%和120%的供試品溶液，密閉，陰涼避光處保存。以空白溶劑為對(duì)照，分別在保存1、2、4、8、12、24 h后于282、320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算間苯二酚含量。結(jié)果顯示，間苯二酚含量值變化很小，RSD＝0.61%（n＝6）。

2.6 樣品含量測(cè)定

精密量取3個(gè)不同批次的復(fù)方間苯二酚洗劑1 ml，置于100 ml量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。精密量取此液5 ml，置于100 ml量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻，制成供試品溶液。同時(shí)，采用相同溶劑，配制含間苯二酚25 μg/ml、水楊酸5 μg/ml的對(duì)照品溶液。以空白溶劑為對(duì)照，分別在282、320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定供試品溶液吸光度AS282、AS320和對(duì)照品溶液吸光度AR282、AR320，計(jì)算吸光度差值ΔAS＝AS282－AS320和ΔAR＝AR282－AR320，按公式c＝ΔAS/ΔAR×5.0計(jì)算間苯二酚含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab 2 Results of content determination of samples（%）

3 討論

雙波長(zhǎng)分光光度法是藥品檢驗(yàn)和環(huán)境分析中常用的定量分析方法，具有簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，常用于同時(shí)測(cè)定兩種物質(zhì)的含量。有文獻(xiàn)顯示，該方法已經(jīng)用于含等摩爾比間苯二酚與水楊酸（1 ∶1）制劑的定量分析[3]。但是，本研究涉及的制劑中，間苯二酚與水楊酸的摩爾比為5 ∶1，其定量分析存在特殊性：其一，由于2010年版《中國(guó)藥典》推薦的最佳吸光度值范圍為0.3～0.7，試驗(yàn)證明難以將兩者的吸光度值同時(shí)調(diào)整至最佳范圍。例如，以間苯二酚的最大吸收波長(zhǎng)276 nm和水楊酸的最大吸收波長(zhǎng)303 nm為例，當(dāng)間苯二酚（30 μg/ml）吸光度值為0.57時(shí)，水楊酸（6 μg/ml）吸光度值僅有0.17；而增大質(zhì)量濃度并使水楊酸（12 μg/ml）吸光度值為0.33時(shí)，間苯二酚（60 μg/ml）的吸光度值就超過(guò)了1.11；而二者疊加后的吸光度值會(huì)更大。因此難以同時(shí)對(duì)本制劑濃度配比下的間苯二酚與水楊酸進(jìn)行測(cè)定。其二，當(dāng)水楊酸吸光度值達(dá)到0.3以上時(shí)，5倍于其的間苯二酚吸收光譜產(chǎn)生了一定的拉伸效應(yīng)，并在303 nm波長(zhǎng)處保持著大于0.01且波動(dòng)增長(zhǎng)的吸光度值，可能對(duì)水楊酸的測(cè)定產(chǎn)生影響。其三，間苯二酚具有一定毒性，可經(jīng)皮膚吸收而中毒，需要在使用過(guò)程中進(jìn)行含量控制。因此，一般選擇間苯二酚作為復(fù)方間苯二酚洗劑的含量測(cè)定成分。

在測(cè)定波長(zhǎng)的選擇方面，276 nm與282 nm均為間苯二酚的最大吸收波長(zhǎng)，均可作為測(cè)定波長(zhǎng)。但是，由于水楊酸濃度較低且其最大吸收波長(zhǎng)在303 nm附近，若選擇282 nm會(huì)使得水楊酸的吸光度值更大且更接近對(duì)稱中心（303 nm），而減小隨機(jī)誤差帶來(lái)的影響并增加對(duì)稱參比的可信度。故選擇282 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)、320 nm為參比波長(zhǎng)，試驗(yàn)證明兩者吸光度差值與間苯二酚質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好。理論上，在保證間苯二酚吸光度值在0.3～0.7內(nèi)的基礎(chǔ)上，任何增加水楊酸吸光度值的方法均可以提高測(cè)定的準(zhǔn)確率，包括調(diào)整測(cè)定波長(zhǎng)、按比例提高整體濃度等。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，選擇間苯二酚在282、320 nm波長(zhǎng)處采用雙波長(zhǎng)分光光度法進(jìn)行復(fù)方間苯二酚洗劑（外用制劑）的含量測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果滿意。

另外需要注意的是，《中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范》和北京市《醫(yī)療單位制劑規(guī)程》中均收載有“復(fù)方間苯二酚洗劑”，但是二者的處方組成卻不相同。前者主要由間苯二酚、苯酚和硼酸等組成，已有采用分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定的報(bào)道[5，7]；而后者則由間苯二酚、水楊酸等組成，尚缺少相關(guān)研究。因此，本研究對(duì)此是一個(gè)有益的補(bǔ)充。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：二部[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：370、附錄Ⅵ.

[2]顧麗紅，孔祥瑞，華拯敏，等.復(fù)方間苯二酚搽劑的制備及應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2002，13（9）：531.

[3]方維軍，陳堅(jiān)，吳芳.雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定復(fù)方薄荷腦洗劑的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2001，21（12）：727.

[4]商國(guó)美，俞佳.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方水楊酸洗劑中水楊酸和間苯二酚的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2005，22（1）：74.

[5]沈德榮.雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定復(fù)方間苯二酚洗劑中間苯二酚的含量[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2008，46（34）：85.

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[7]陳軍，陳燕華，刁雨輝，等.雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定復(fù)方間苯二酚洗劑中間苯二酚的含量[J].中國(guó)藥房，2003，14（6）：362.