劉 蓓,王麗華

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

蜜蜂發(fā)育相關(guān)基因研究

劉 蓓,王麗華

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

蜜蜂是一種重要的授粉昆蟲，也是研究人類疾病及社會(huì)行為的模式生物之一。由其基因組測(cè)序可知，蜜蜂基因組中(A+T)及CpG含量較高，其晝夜節(jié)律、RNAi和DNA甲基化基因更類似脊椎動(dòng)物。先天免疫、表皮蛋白和味覺受體基因較少，氣味受體基因較多。蜜蜂早期發(fā)育途徑中的一些基因與果蠅的相似，功能卻顯著不同。本文綜述了蜜蜂卵、幼蟲、蛹和成蟲期發(fā)育相關(guān)基因及其研究進(jìn)展。

蜜蜂; 發(fā)育時(shí)期; 發(fā)育基因

作為一種社會(huì)性昆蟲，蜜蜂(Apismellifera)可以傳播花粉，在生態(tài)環(huán)境和生物多樣性中起重要作用；作為一種模式生物，蜜蜂可以用來研究人類的過敏反應(yīng)、長(zhǎng)壽、代謝疾病、學(xué)習(xí)記憶能力和社會(huì)行為等。繼果蠅、蚊子和家蠶之后，蜜蜂基因組在2006年被破譯，科學(xué)家們分析了蜜蜂基因組的16對(duì)染色體，發(fā)現(xiàn)約10000個(gè)基因，比其他已測(cè)序昆蟲的基因總數(shù)少得多，蜜蜂基因組富含(A+T)區(qū)域和CpG結(jié)構(gòu)，缺乏主要的轉(zhuǎn)座子家族。2014年蜜蜂基因組測(cè)序升級(jí)版(Amel_4.5)發(fā)現(xiàn)了新的基因集，包含5000個(gè)以上與其他昆蟲基因組相似的蛋白質(zhì)編碼基因，比2006年的報(bào)道多了50%，顯著增加了蜜蜂的基因組資源[1]。西方蜜蜂基因組測(cè)序結(jié)果的公布，加深和便利了蜜蜂基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，尤其是個(gè)體發(fā)育基因組學(xué)的研究。蜜蜂個(gè)體發(fā)育包括從卵變?yōu)槌上x的整個(gè)過程，即從卵細(xì)胞開始，歷經(jīng)卵期、幼蟲期、蛹期直至羽化為成蜂。在整個(gè)胚后發(fā)育(包括蛻皮和變態(tài))過程中，涉及到很多發(fā)育基因的上調(diào)表達(dá)與下調(diào)表達(dá)，有些基因的表達(dá)甚至延續(xù)到成蟲期。

1 卵期發(fā)育基因

1.1 體軀分節(jié)

果蠅(Drosophilamelanogaster)的體節(jié)形成主要是以下幾類基因共同作用的結(jié)果：母體基因(maternal gene)；分節(jié)基因，包括間隙基因(gap gene)、成對(duì)基因(pair-rule gene)和體節(jié)極性基因(segment polarity gene)；同源異型基因(homeotic gene)。母體基因激活分節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，決定胚胎的前后軸和背腹軸。蜜蜂母體基因缺乏果蠅中決定胚胎末端形成的trunk和torso基因，以及組成果蠅背腹信號(hào)系統(tǒng)的gurken基因。蜜蜂中沒有bicoid基因(在果蠅中決定胚胎前部區(qū)域的發(fā)育)，改由擬谷盜屬的Orthodenticle(早期胚胎頭部分區(qū))和hunchback基因(胚胎分區(qū))取代，同時(shí)也沒有oskar基因(在果蠅中與極質(zhì)分布有關(guān))。間隙基因與蟲體的頭、尾結(jié)構(gòu)相關(guān)，也與主要體節(jié)形成有關(guān)。成對(duì)基因的產(chǎn)物形成不同的胚胎分區(qū)，即類體節(jié)，是體節(jié)形成的基礎(chǔ)。Wilson et al[2]研究了果蠅成對(duì)基因在蜜蜂中的同源物Am-eve、Am-run、Am-h和Am-ftz等的表達(dá)與功能，發(fā)現(xiàn)它們調(diào)控母體基因和間隙基因的表達(dá)，并在早期頭胸分區(qū)布局以及胚胎分節(jié)中起作用。體節(jié)極性基因的產(chǎn)物沿前后軸呈帶狀分布，控制著各布局內(nèi)主副體節(jié)的結(jié)構(gòu)，包括極性。分節(jié)基因又激活同源異型基因，同源異型基因的突變會(huì)導(dǎo)致身體附肢發(fā)育的異常和移位，即基因產(chǎn)物的異位表達(dá)。

1.2 性別決定

蜜蜂沒有性染色體，其性別由互補(bǔ)性性別決定因子csd(complementary sex determiner)所決定。csd通過控制fem(feminizer，雌性基因)下游的選擇性剪切來決定蜜蜂的性別，被認(rèn)為和果蠅中tra(transformer，控制體細(xì)胞性別分化)的功能等同。蜜蜂中缺乏果蠅tra的直系同源物，但有1個(gè)果蠅tra2的同源基因Am-tra2，是Am-dsx(doublesex，雙性基因)轉(zhuǎn)錄的重要成分。Schmieder et al[3]通過蜜蜂間以及蜜蜂和螞蟻間fem和csd的序列比對(duì)，認(rèn)為csd是在膜翅目細(xì)腰亞目針尾部分化之前由fem的重復(fù)演變所產(chǎn)生。由于fem在雄性和雌性通道間轉(zhuǎn)換，從而將csd的等位基因多樣性與發(fā)育程序聯(lián)系起來。此外，蜜蜂中還有果蠅的dsx和ix(intersex，間性基因)的直系同源物，但dsx被性別特異性剪輯了。

蜜蜂在性別決定上缺乏劑量補(bǔ)償，卻有在果蠅中控制劑量補(bǔ)償?shù)膍le(maleless，調(diào)節(jié)雄性中多肽基因Sgs-4的轉(zhuǎn)錄水平)、mof(males absent on the first，維持基因組穩(wěn)定性)、msl-3(male-specific lethal 3，X染色體上基因轉(zhuǎn)錄)和Trl(Trithorax-like，編碼GAGA轉(zhuǎn)錄因子)的同源基因，這些基因可能在蜜蜂中有附加功能。因?yàn)樾鄯涫菃伪扼w，精子發(fā)生時(shí)缺乏減數(shù)分裂，所以7個(gè)與雄性減數(shù)分裂有關(guān)的果蠅基因，蜜蜂只有3個(gè)，分別是bol〔boule，通過控制減數(shù)分裂細(xì)胞分裂周期25(Cdc25)磷酸酶的轉(zhuǎn)錄而作用于精子發(fā)生〕、crl(courtless，雄性求偶行為相關(guān))和topi(matotopetli，編碼睪丸特異性鋅指蛋白)。

2 幼蟲期發(fā)育基因

2.1 級(jí)型分化

蜂王和工蜂同樣是由二倍體受精卵發(fā)育而來，其遺傳基礎(chǔ)相同，但由于在發(fā)育過程中得到的空間大小及食物質(zhì)量差異，使得它們?cè)诔砷L(zhǎng)過程以及長(zhǎng)大以后在諸多外部形態(tài)學(xué)和內(nèi)部解剖學(xué)、生理學(xué)特征方面以及眾多基因表達(dá)方面都強(qiáng)烈地按照級(jí)型的不同而有所差異，包括壽命、生殖能力和行為等。其中，由哺育蜂頭部咽下腺和上顎腺分泌的蜂王漿是級(jí)型分化的關(guān)鍵物質(zhì)。Kamakura[4]發(fā)現(xiàn)，蜂王漿中的一種57 ku蛋白R(shí)oyalactin是級(jí)型分化誘導(dǎo)中主要的功能活性因子，Royalactin可誘導(dǎo)蜜蜂幼蟲在蟲蛹期體型增加、卵巢發(fā)育和發(fā)育歷期縮短并最終發(fā)育成為蜂王，也可誘導(dǎo)果蠅長(zhǎng)成碩大的“蠅后”(身體大小和育性增加，壽命延長(zhǎng)、發(fā)育期縮短)。即在幼蟲的脂肪體中激活p70 S6激酶(S6K，增大體型)和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)，促使20E(20-hydroxyecdysone)合成增加而縮短發(fā)育期。與此同時(shí)，響應(yīng)Royalactin的胰島素通路激活了保幼激素(卵巢發(fā)育所必需)合成，從而導(dǎo)致卵黃蛋白(育性增加所必需)表達(dá)量增加。但在沉默了蜜蜂和果蠅脂肪體的表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,Egfr)后，它們的前胸腺(prothoracic gland)、咽側(cè)體(corpora allata)和脂肪體的發(fā)育出現(xiàn)了同步化停滯，其成蜂體型和卵巢管變小，發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)，說明Egfr信號(hào)通路參與了工蜂和蜂王的級(jí)型分化。

蜜蜂的級(jí)型分化是一個(gè)典型的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，即在不改變基因組序列的前提下，通過DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNAs(microRNAs)來調(diào)控基因的表達(dá)。Spannhoff et al[5]發(fā)現(xiàn)，蜜蜂的級(jí)型分化部分歸因于蜂王漿中的組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histon deacetylase inhibitor,HDACi)活性，而10-羥基-2癸烯酸〔(E)-10-hydroxy-2-decylennic acid,10-HDA〕是產(chǎn)生這一活性的主要物質(zhì)。用10-HDA含量高的蜂王漿養(yǎng)育出來的蜜蜂雌性個(gè)體，往蜂王方向發(fā)育的傾向更大。這種外源性的HDACi活性打破了蜜蜂體內(nèi)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histon acetyltransferase,HAT)與組蛋白脫乙酰酶(histon deacetylase,HDAC)之間相向催化的平衡，即將已經(jīng)甲基化的組蛋白基因家族重新乙?；?，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)了表觀發(fā)育遺傳學(xué)。Guo et al[6]分析了蜜蜂幼蟲食物中的小RNA(small RNA)組成，發(fā)現(xiàn)工蜂幼蟲吃的工蜂漿(巢房里的漿)中miRNA水平要比蜂王幼蟲吃的蜂王漿(王臺(tái)里的漿)中的miRNA水平高7-215倍，且工蜂漿中miRNA的復(fù)雜度和豐度也更高。對(duì)蜂王漿中添加特定的miRNA(miR-184)后，可引起蜂王幼蟲miRNA表達(dá)和羽化后成年蜂王形態(tài)特征的顯著變化，因此認(rèn)為哺育蜂分泌物中的miRNA是調(diào)控級(jí)型分化的一個(gè)附加成分。

蜂王和工蜂的發(fā)育基因表達(dá)譜表明，其發(fā)育軌跡都與有選擇性剪切功能的基因表達(dá)有關(guān)，蜂王方向的幼蟲在發(fā)育早期參與轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白折疊的基因后以更高的水平參與到能量產(chǎn)生的表達(dá)。對(duì)于72 h的幼蟲還有可發(fā)育為蜂王或工蜂雙潛能的說法，Li et al[7]證明了72 h以前幼蟲已經(jīng)決定了各自的命運(yùn)，因?yàn)?2 h后，蜂王幼蟲趨于過度表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶、醛還原酶、參與碳水化合物代謝和能量產(chǎn)生的烯醇酶蛋白、成蟲盤生長(zhǎng)因子4(一種發(fā)育相關(guān)蛋白)、長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶連接酶和蛋白酶體亞基α型5(代謝脂肪酸和氨基酸)；而工蜂幼蟲趨于過量表達(dá)ATP合酶β亞基、醛脫氫酶、硫氧還蛋白過氧化物酶1和過氧化物還原酶2540、致死因子(2)37和14-3-3蛋白ε、脂肪酸結(jié)合蛋白以及腫瘤抑制蛋白。這2個(gè)級(jí)型幼蟲之間的差異蛋白表達(dá)在120 h后更明顯，與碳水化合物代謝和能量產(chǎn)生相關(guān)的蛋白差異特別顯著。功能聚類分析表明，碳水化合物的代謝和能量產(chǎn)生以及抗氧化蛋白在級(jí)型差異的形成中起重要作用。

蜂王和工蜂間最顯著的差別就是工蜂不可育而蜂王可育。然而，海角蜜蜂(Apismelliferacapensis)的雌性幼蟲憑借積極的索食行為，得到豐盈的更像蜂王漿的食物來激活其卵巢，并最終吃成一個(gè)寄生性的產(chǎn)卵工蜂——利他基因突變型而能夠產(chǎn)生二倍體雌性后代(產(chǎn)雌孤雌生殖)。這是由于13號(hào)染色體上，th位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子gemini的第5個(gè)外顯子后面，因可變剪切在201至210堿基間出現(xiàn)了控制工蜂育性的內(nèi)含子剪切增強(qiáng)子功能域(intronic splice enhancer motif,ISEM)的缺失所造成的。Jarosch et al[8]選擇該區(qū)域?yàn)楹蜻x基因，用RNAi技術(shù)將該功能域從利他的工蜂基因組中敲除，將這只不育工蜂的卵巢快速激活，進(jìn)而使之變成一只自私的產(chǎn)卵工蜂。對(duì)卵巢完全激活和卵巢發(fā)育不全的工蜂血淋巴蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)工蜂育性與免疫系統(tǒng)潛在成分的表達(dá)之間存在相關(guān)性(可育工蜂與之為正相關(guān))。Bloch et al[9]發(fā)現(xiàn)蜜蜂的營養(yǎng)狀態(tài)可以抑制體內(nèi)類胰島素肽(insulin like peptide,AmILP)的分泌，蜂王幼蟲的胰島素—類胰島素信號(hào)通徑(insulin/insulin-like signaling,IIS)較低而工蜂幼蟲的IIS較高，說明AmILP基因的表達(dá)是級(jí)型特異性的。

隨著幼蟲的發(fā)育，工蜂的哺育行為相關(guān)基因與蜂王的生殖行為相關(guān)基因出現(xiàn)了相當(dāng)多的重疊[10]，與發(fā)育分化、細(xì)胞凋亡等有關(guān)的基因也同時(shí)存在，如：蜂王幼蟲表達(dá)的醛還原酶(aldehyde reductase)和烯醇酶(enolase)基因，工蜂幼蟲表達(dá)的醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)和超氧化物還原酶2540(peroxiredoxin 2540)基因[7]。這些都與蜂王的咽下腺(hypopharyneal glands)漸行退化而工蜂的咽下腺日漸發(fā)達(dá)有關(guān)，也與工蜂的上顎腺(mandibular glands)漸行退化而蜂王的上顎腺日漸發(fā)達(dá)有關(guān)。

在幼蟲期，蜂王比工蜂的大腦更大，發(fā)育更迅速，反映了2種級(jí)型的差異喂養(yǎng)方式對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響。Moda et al[11]比較了蜂王和工蜂3-5日齡幼蟲的大腦發(fā)育形態(tài)學(xué)。在仍取食的末齡幼蟲(L5F)中，蜂王幼蟲的蘑菇體可識(shí)別到蕈狀體柄和蕈體冠，工蜂幼蟲中無法識(shí)別。從第3到首次吐絲的第5日齡(L3至L5S1)幼蟲中確定了21個(gè)級(jí)型特異性基因的轉(zhuǎn)錄譜，這些基因編碼的蛋白通過控制細(xì)胞增殖率(APC4,kr-h1基因)和肌束震顫(GlcAT-P,fax和shot基因)牽涉到大腦組織發(fā)育。

此外，工蜂和蜂王的附肢形態(tài)學(xué)差異極顯著，尤其是工蜂后足脛節(jié)有一個(gè)可以攜帶花粉和蜂膠的花粉筐，而蜂王無此結(jié)構(gòu)。Bomtorin et al[12]利用預(yù)蛹后足的成蟲盤RNA，做了2個(gè)級(jí)型的基因組水平的寡核苷酸陣列雜交，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)基因，包括級(jí)型優(yōu)先表達(dá)的表皮蛋白(cuticle protein,CP)基因和細(xì)胞色素P450家族成員，另外還確定了8個(gè)足部發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄譜，包括abdominal-A、distal-less和ultrabithorax(Ubx)，其中Ubx在工蜂后足中的表達(dá)幾乎是蜂王的25倍，而Ubx決定著2種級(jí)型成蟲后足的脛節(jié)/基附節(jié)的形態(tài)學(xué)特征。

2.2 DNA甲基化

蜜蜂基因組整體上的甲基化水平很低，僅有3種DNA胞嘧啶-5-甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA cytosine-5-methyltransferases,Dnmts)，分別是Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3，與哺乳動(dòng)物特別是人類的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的同源性極高，其中Dnmt1和Dnmt3非常活躍。Dnmts發(fā)生在CpG位點(diǎn)上轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)而非3′和5′末端，這點(diǎn)與人和脊椎動(dòng)物略微不同。蜜蜂體內(nèi)發(fā)生DNA甲基化的基因分為兩類：一類是CpG含量很高，即high-CpG基因，參與生物體的個(gè)體發(fā)育；另一類是CpG含量很低，即low-CpG基因，與代謝和核酸加工有關(guān)。DNA甲基化的發(fā)生具有很強(qiáng)的特異性，當(dāng)環(huán)境因素激活或抑制級(jí)型分化基因的表達(dá)時(shí)，幼蟲的發(fā)育方向就受到了調(diào)控。蜜蜂基因組中富含CpG，因此為DNA甲基化的發(fā)生提供了有利條件。

Dnmt3是影響蜜蜂基因組重新編程的一個(gè)主要驅(qū)動(dòng)子，如專管級(jí)型確定。Kucharski et al[13]研究表明，如果將Dnmt3沉默，則“斷漿期”幼蟲的dynactinp62 基因(果蠅的飲食改變響應(yīng)基因)表達(dá)上調(diào)，約72%工蜂幼蟲開始向蜂王方向發(fā)育(有50-80條卵巢小管)并最終發(fā)育成為蜂王(有120-190條卵巢小管)，初生重、體長(zhǎng)、第3背板長(zhǎng)等顯著提高，與飼喂蜂王漿長(zhǎng)大的個(gè)體形態(tài)沒有區(qū)別，足見去DNA甲基化修飾也能誘導(dǎo)出與食用蜂王漿同樣的效應(yīng)。當(dāng)測(cè)定自然王臺(tái)和工蜂巢房中2日齡和6日齡幼蟲體內(nèi)Dnmt3酶活性、Dnmt3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和dynactinp62基因甲基化水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)2日齡的幼蟲受甲基化影響很少，而6日齡的蟲體內(nèi)甲基化水平卻存在明顯差異。劉亭亭等[14]采用熒光定量PCR檢測(cè)不同發(fā)育時(shí)期工蜂(4日齡蛹、1日齡工蜂及產(chǎn)卵工蜂)和蜂王(4日齡蛹、1日齡蜂王和產(chǎn)卵蜂王)頭部的Dnmt3基因mRNA的表達(dá)量。結(jié)果表明，該基因在蜂王蛹中的表達(dá)量顯著高于工蜂蛹，1日齡蜂王中的表達(dá)量顯著高于1日齡工蜂，產(chǎn)卵工蜂與產(chǎn)卵蜂王中的表達(dá)量未見差異，以上表明Dnmt3可能與勞動(dòng)分工及卵巢發(fā)育有關(guān)。

Lyko et al[15]進(jìn)行了基因組測(cè)序驗(yàn)證，以確定甲基胞嘧啶(MC)在蜂王和工蜂大腦中的分布差異，結(jié)果表明，總共有550多個(gè)基因顯示了甲基化作用的顯著差異，而CpG的密度強(qiáng)化了這種差異的獨(dú)特性。此外，在甲基化模式和剪切位點(diǎn)之間也有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，這種關(guān)聯(lián)是由組蛋白家族基因的差異甲基化所支持的。Ikeda et al[16]發(fā)現(xiàn)雖然Hex110基因(hexamerin 110，編碼貯藏蛋白)的整體甲基化水平較低，但在成蜂期比在幼蟲期高。其中不乏有一些CpG位點(diǎn)的甲基化水平相對(duì)較高，且在工蜂幼蟲和蜂王幼蟲之間存在差異。這些高度甲基化的位點(diǎn)位于Hex110基因外顯子區(qū)域，以一種級(jí)型依賴性的方式調(diào)節(jié)著發(fā)育，其基因轉(zhuǎn)錄物在蜂王中的表達(dá)水平比在工蜂中高。

3 蛹期發(fā)育基因

3.1 頭部發(fā)育

Zheng et al[17]發(fā)現(xiàn)蜂蛹頭部有58個(gè)蛋白在13、15、17、19和20日齡時(shí)改變了表達(dá)，其中36個(gè)參與頭部器官形成的蛋白在早期(13-17日齡)上調(diào)表達(dá)，而22個(gè)參與蛹頭部神經(jīng)元和腺體發(fā)育的蛋白在發(fā)育后期(19-20日齡)上調(diào)表達(dá)。前期上調(diào)表達(dá)的蛋白功能主要包括碳水化合物代謝與能量產(chǎn)生，蛋白質(zhì)生物合成及折疊，氨基酸與核苷酸代謝，以及充當(dāng)細(xì)胞骨架及載體；后期上調(diào)的蛋白功能則主要是抗氧化和脂肪酸代謝。

3.2 外骨骼及骨骼肌形成

Soares et al[18]分別在外骨骼形成之前、當(dāng)中和之后進(jìn)行采樣，應(yīng)用全基因組寡核苷酸微陣列來篩選參與蜜蜂胸背外骨骼形成的基因。成蟲外骨骼形成時(shí)在表皮中2種新基因大量表達(dá)，暗示它們就是真正的表皮蛋白(CP)基因。通過保守基序確定了此類CP基因?yàn)镃PR、Tweedle、Apidermin、CPF、CPLCP1和類似Peritrophins家族的成員。在外骨骼下附著的橫紋肌纖維形成過程中，有28個(gè)與肌肉相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)。上調(diào)表達(dá)的這15個(gè)CP基因和21個(gè)肌肉相關(guān)基因享有共同的組分，表明在胸腔外骨骼形成中它們是共同調(diào)節(jié)的。這些發(fā)現(xiàn)有助于揭示自蛹蛻變?yōu)槌上x這一期間由蛻皮類固醇協(xié)調(diào)的剛性胸外骨骼形成的分子基礎(chǔ)。

4 成蟲期發(fā)育基因

4.1 幼蟲的喂養(yǎng)

蜂王漿是蜂王和小幼蟲的主要食物，其主要成分是王漿主蛋白(major royal jelly proteins,MRIPs)。MRIPs家族有9個(gè)基因，均由古老的編碼黃色蛋白(YELLOW)家族的基因進(jìn)化而來，排列在1個(gè)60 kb的串聯(lián)序列上，在各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，是一個(gè)基因家族在社會(huì)性進(jìn)化過程中獲得新功能的很好范例。

4.2 社會(huì)分工

咽下腺是工蜂分泌蜂王漿與轉(zhuǎn)化酶的腺體，上顎腺是蜂王分泌信息素的腺體。工蜂咽下腺選擇性表達(dá)的脂肪酸合酶 (fatty acid synthase,FAS)與王漿中脂肪酸不同組分有關(guān)；蜂王上顎腺選擇性表達(dá)的乙醛脫氫酶1(ALDH1)與蜂王信息素合成有關(guān)。

Guan et al[19]對(duì)來自同一蜂群的哺育蜂、覓食蜂和轉(zhuǎn)換后的哺育蜂(覓食一段時(shí)間后又轉(zhuǎn)換為哺育蜂)進(jìn)行了數(shù)字基因表達(dá)分析和甲基DNA免疫沉淀分析。結(jié)果表明，在覓食蜂與哺育蜂的比較以及轉(zhuǎn)換后的哺育蜂與覓食蜂的比較中，分別確認(rèn)了874與710種差異顯著的表達(dá)基因和366與442種差異顯著的甲基化基因，有少數(shù)基因既差異表達(dá)又差異甲基化。以上證實(shí)，相關(guān)基因表達(dá)和DNA甲基化改變都和哺育蜂和覓食蜂的勞動(dòng)分工相關(guān)。例如飛行中的覓食頻率和視覺體驗(yàn)與不同的蘑菇體(MB)神經(jīng)元活性有關(guān)，覓食蜂是采集花蜜還是采集花粉的行為受到生殖生理學(xué)的影響，如激素水平或卵黃蛋白原基因(vitellogenin,vg)的表達(dá)。

Gempe et al[20]混合了500只新羽化的帶有低(L)和高(H)衛(wèi)生行為基因型的工蜂，發(fā)現(xiàn)這種基因型的混合影響了L型工蜂在執(zhí)行清潔任務(wù)中的行為參與和工蜂在打開封蓋子巢房時(shí)的配合，以及不同清潔任務(wù)之間的轉(zhuǎn)換。蜂群中發(fā)生的這種間接基因型影響，是因?yàn)楣し溟g大量的互動(dòng)產(chǎn)生了表型和基因型的相互作用。在分析了混合后L型工蜂和純L型工蜂的943個(gè)差異表達(dá)的基因后發(fā)現(xiàn)，大腦組織中的細(xì)胞成分、蛋白定位、發(fā)育生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài)等的變化，對(duì)神經(jīng)元基板的調(diào)整和修飾間接地起著類似遺傳效應(yīng)的作用。這種由群居同伴的基因型而影響的個(gè)體行為反應(yīng)能力，顯示出基因架構(gòu)—行為表現(xiàn)的復(fù)雜性。

Ament et al[21]用RNAi敲除了工蜂腹部脂肪體的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子usp(ultraspiracle，維甲酸X受體的昆蟲同系物)，延遲了哺育蜂到覓食蜂的角色轉(zhuǎn)換。由于usp通過介導(dǎo)保幼激素(juvenile hormone,JH)誘導(dǎo)了脂肪體中許多與成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)著行為可塑性。

4.3 氣味識(shí)別

昆蟲氣味識(shí)別的過程大概是：氣味結(jié)合蛋白(OBPs)或化學(xué)感受蛋白(CSPs)先與脂溶性的氣味分子結(jié)合，形成的復(fù)合物擴(kuò)散到神經(jīng)元樹突膜表面的氣味受體(ORs)上，氣味受體受到刺激后，膜通透性發(fā)生改變，產(chǎn)生動(dòng)作電位，同時(shí)氣味分子在OBPs作用下又迅速失活，然后在氣味降解酯酶和谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶的作用下降解。相對(duì)于果蠅和按蚊(Anophelesgambiae)，蜜蜂中含有大量的氣味受體基因(170個(gè)氣味受體基因，其中7個(gè)假基因)，它們分為5個(gè)亞家系，前4個(gè)亞家系很小，第5個(gè)亞家系包括157個(gè)氣味受體。蜜蜂基因組編碼21種氣味結(jié)合蛋白OBPs，此外還編碼6個(gè)化學(xué)感受蛋白CSPs。與大量控制嗅覺的基因相比，蜜蜂的味覺受體極少，只有10個(gè)不成簇的味覺受體基因。雖然有推測(cè)說一些氣味受體可能作為味覺受體，但這也與蜜蜂較強(qiáng)的嗅覺行為和較弱的味覺行為相一致。

Zhao et al[22]對(duì)中蜂的氣味受體基因AcerOr2(果蠅Or83b的直系同源物)進(jìn)行了序列比對(duì)、實(shí)時(shí)定量PCR和原位雜交分析，發(fā)現(xiàn)它與膜翅目其他物種的嗅覺受體有很高的同源性(>74%)，與意蜂的同源性達(dá)到99.8%。在幼蟲階段，AcerOr2的轉(zhuǎn)錄水平較低，但在蛹期特別是在羽化前后顯著增高。AcerOr2的mRNA在板型感受器和工蜂觸角表皮的基底區(qū)域有表達(dá)，這與先前的保守基因大都在嗅覺受體神經(jīng)元中表達(dá)的結(jié)論相一致。

4.4 晝夜節(jié)律

蜜蜂中存在著果蠅生物鐘蛋白基因Cry(cryptochrome)、Tim(timeless)、Clk(clock)和Cyc(cycle)的直系同源物AmCry、AmTim2、AmClk和AmCyc，大多數(shù)與生物鐘的“負(fù)反饋”調(diào)節(jié)有關(guān)。比起果蠅，它們與哺乳動(dòng)物的更相似，更像是哺乳動(dòng)物的直系同源基因。

4.5 表皮、免疫及解毒系統(tǒng)

基因組研究表明，蜜蜂表皮蛋白基因只有不到果蠅和按蚊的三分之一，而免疫途徑(如Toll,Imd和JAK/STAT)更少。這可能表明蜜蜂中有新的免疫途徑，只是在個(gè)體水平上抵御病原體的能力不佳。Bull et al[23]比較了年長(zhǎng)的覓食蜂和年幼的哺育蜂對(duì)病原的易感性，發(fā)現(xiàn)哺育蜂有35個(gè)而覓食蜂中只有2個(gè)候選免疫基因的差異表達(dá)，推測(cè)覓食蜂的病原體易感性減弱與免疫系統(tǒng)途徑的年齡特異性有關(guān)。

與果蠅和按蚊相比，蜜蜂中與殺蟲劑代謝相關(guān)的基因較少，如羧酸酯酶基因(CCE)、細(xì)胞色素P450基因(P450)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)。這些解毒基因少，使其對(duì)某些殺蟲劑異常敏感。同時(shí)，殺蟲劑殘留易集聚在親脂性物質(zhì)如蜂蠟或花粉上，這大大地影響著自身免疫力相對(duì)低下的蜂子的發(fā)育和蜂王的產(chǎn)卵力。

Williamson et al[24]給成年覓食工蜂飼喂亞致死劑量濃度的單種化合物(蠅毒磷、涕滅威、樂斯本或多奈哌齊)蔗糖溶液，記錄其在24 h內(nèi)行走、逗留、梳理和持續(xù)倒掛行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梳理活動(dòng)和行為發(fā)作頻率顯著增加，如頭部的梳理。蠅毒磷可引起不適的癥狀，如梳理腹部和排便。該4種化合物或它們的代謝物對(duì)蜜蜂起著乙酰膽堿酯酶抑制劑的作用，有2種乙酰膽堿酯酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平在大腦和內(nèi)臟中上調(diào)。因此，針對(duì)類膽堿能信號(hào)傳導(dǎo)的殺蟲劑可能導(dǎo)致蜜蜂神經(jīng)肌肉功能的紊亂進(jìn)而做出對(duì)其生存不利的行為。

Palmer et al[25]使用來自于蜜蜂大腦中的蘑菇體凱尼恩細(xì)胞記錄，證明了2種類膽堿農(nóng)藥可以引起神經(jīng)元放電的去極化阻斷，抑制煙堿回應(yīng)。其中，新煙堿類(煙堿受體激動(dòng)劑)殺蟲劑吡蟲啉和噻蟲胺可造成認(rèn)知障礙，其亞致死效應(yīng)會(huì)影響蜜蜂的學(xué)習(xí)和對(duì)氣味的反應(yīng)；膽堿能信號(hào)抑制型殺蟲劑和有機(jī)磷殺螨劑氧蠅毒磷可引起覓食蜂的藥物中毒，而這將直接影響到蜜蜂能否被成功地招募出去和高效率地進(jìn)行授粉。

Derecka et al[26]用含有低水平吡蟲啉的糖漿投喂給田間的蜂巢，然后對(duì)工蜂幼蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的分析，檢測(cè)到大量處于脂質(zhì)—碳水化合物—線粒體代謝網(wǎng)中的基因：編碼P450解毒酶基因的RNA水平升高，而協(xié)同糖酵解和糖代謝途徑的基因下調(diào)；對(duì)脅迫做出應(yīng)激響應(yīng)的hsp90基因的表達(dá)減少，進(jìn)而引起成蜂能量代謝基因的下調(diào)。

4.6 多巴胺和血清素

蜜蜂使用2個(gè)獨(dú)立的神經(jīng)通路來避免食物中的有毒氣味，即有2種引起條件性厭食的機(jī)制：一種機(jī)制是先用喙攝取檢測(cè)食物，之后在神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的介導(dǎo)下學(xué)會(huì)將氣味與毒素聯(lián)系起來；另一種機(jī)制是在5-HT(5-羥色胺，又稱血清素Serotonin)介導(dǎo)下學(xué)會(huì)避免由于攝入毒素而引起的氣味不適。受體介導(dǎo)的5-HT可以調(diào)控動(dòng)物的生理與行為，在蜜蜂中主要牽涉勞動(dòng)分工、視覺處理和學(xué)習(xí)過程。Thamm et al[27]通過Ca2+成像和定量PCR研究了蜜蜂5-HT2受體Am5-HT2A和Am5-HT2B的表達(dá)和藥理特性，發(fā)現(xiàn)只有有活性的5-HT受體可以引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度提高，這種效果與興奮劑5-甲氧基色胺(5-methoxytryptamine)和低濃度的5-HT1A受體激動(dòng)劑8-OH-DPAT 〔8-hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin〕相似，可長(zhǎng)效抑制5-HT2A受體的功能狀態(tài)。5-HT受體活性可被拮抗劑如氯氮平(clozapine)、美賽西平(methiothepin)或米安色林(mianserine)所阻斷。在蜜蜂的外分泌腺體中檢測(cè)到高轉(zhuǎn)錄物，表明5-HT2受體參與了蜜蜂的分泌過程。

5 小結(jié)

發(fā)育是由時(shí)間控制的基因被活化、由空間限制的表型被塑造的一個(gè)有序性事件發(fā)生過程。本文所提到的蜜蜂胚后發(fā)育特別是級(jí)型的可塑性發(fā)育，印證了這一過程。其級(jí)型分化軌跡和漸進(jìn)的器官長(zhǎng)成由前期的進(jìn)食量(調(diào)控著發(fā)育基因的開啟與關(guān)閉)可能還有生長(zhǎng)空間所規(guī)定完成：未來的“普通勞動(dòng)者”工蜂，其幼蟲是蝸居在巢房里，以零飼形式(漸進(jìn)性飼喂)啜飲著由花蜜和花粉發(fā)酵而成的蜂糧糊慢慢長(zhǎng)大；未來的“蜂群統(tǒng)領(lǐng)者”蜂王，其幼蟲則是居住在王臺(tái)里，以整飼形式(一次性飼喂)徜徉在蜂王漿中超速養(yǎng)大。導(dǎo)致長(zhǎng)大化蛹直至羽化為成蟲出房后，工蜂卵巢失活，身上長(zhǎng)著明顯是用來做利他性勞役的附肢與腺體(勞動(dòng)分工中的特有形態(tài)構(gòu)造)；而蜂王大腹便便，卵巢飽滿(勞動(dòng)分工中的主要看家器官)，身上的附肢與腺體全是與婚飛、巢房標(biāo)記、蜂群震懾有關(guān)。所有這些，都是一個(gè)由眾多分子事件參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的作用結(jié)果，是基因組發(fā)育基因及其相關(guān)基因的相互作用。

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(責(zé)任編輯:陳幼玉)

Astudyofdevelopment-relatedgenesinhoneybee

LIU Bei,WANG Li-hua

(College of Apicultural Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China)

Honeybee is not only an important pollinator,but also one of important model organisms to study on human diseases and social behaviors. It is known from the genome sequencing that there is a high (A+T) content and a high CpG content in honeybee genome. The genes of circadian rhythm,RNAi and DNA methylation are more similar to those in vertebrate. Fewer genes about innate immunity,cuticle protein and gustatory receptors and more ones about odorant receptors are involved in the honeybee genome. However,genes similar to theDrosophilain early development pathways carry out functions significantly different in honeybee genome. This paper reviews recent studies on developmental genes at egg,larval,pupal and adult stages in honeybee.

honeybee (Apismellifera); developmental stages; developmental genes

2014-04-03

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2009N0003)。

劉蓓(1989-)，女，碩士研究生。研究方向：蜜蜂飼養(yǎng)與繁育。通訊作者王麗華(1960-)，女，教授。研究方向：蜂學(xué)。Email：leahwang131@163.com。

Q963;S891

A

1673-0925(2014)02-0126-08