韓永剛陳忠壽黃風云

牙周炎齦溝液中HMGB1、2的表達及意義*

韓永剛①陳忠壽①黃風云①

目的：探討HMGB1、HMGB2與NO在牙周炎發(fā)病中的相關(guān)性，以了解HMGB1、HMGB2在牙周炎發(fā)病中可能的生物學作用。方法：選取2012年3月-2014年3月本院牙科收治的106例牙周炎患者作為試驗組，另外選取本院牙齒健康體檢者58例作為對照組。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定HMGB1、HMGB2及硝酸還原法測定NO在齦溝液中的含量，分析HMGB1、HMGB2與NO在牙周炎齦溝液中的相關(guān)性。結(jié)果：兩組HMGB1、HMGB2和NO三個指標的比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表示HMGB1、HMGB2和NO三個指標在牙周炎齦溝液中的表達與正常人比較異常增高。HMGB1和HMGB2與NO的水平作Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.875、0.848（P＜0.05），均呈正相關(guān)。結(jié)論：HMGB1、HMGB2可能是牙周炎中的重要炎因子之一。

牙周炎； 齦溝液； 高遷移率蛋白； 一氧化氮

牙周炎是患者牙周部位受到感染時，機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗感染作用時導致牙周炎癥介質(zhì)及毒性自由基聚集所引起的一系列炎癥感染癥狀。牙周炎通常為慢性炎癥逐漸發(fā)展為急性炎癥，也就是牙周炎的活躍期[1-2]。牙周炎可侵犯牙周組織，造成炎癥破壞性疾病，主要為牙周袋及袋壁的炎癥，從而導致牙槽骨吸收及牙齒逐漸松動甚至脫落，牙周炎是導致成年人缺牙的主要原因，其主要的炎癥反應(yīng)是過度的機體免疫反應(yīng)所造成的自我破壞[3-4]。研究牙周炎的炎癥因子HMGB1、HMGB2與NO發(fā)病中的作用有重要的意義。故本文通過ELISA檢測牙周炎患者齦溝液中HMGB1、HMGB2與NO的表達量，可通過相關(guān)回歸曲線分析它們的關(guān)系，了解其與牙周炎發(fā)病進展中可能存在的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月-2014年3月本院牙科收治的106例牙周炎患者作為試驗組，患者牙頸部無齲損、無充填體，平均年齡（42±12）歲。另外選取本院牙齒健康體檢者58例作為對照組，所有體檢者均為未發(fā)生過牙周疾病人群，平均年齡（24±5）歲，不吸煙，未妊娠，至少1個月內(nèi)未使用過抗生素及非甾體抗炎藥或者其他影響白細胞的藥物，與其簽署知情同意書。

1.2 實驗標本 每2 mm×10 mm濾紙條放入一個微離心管中進行消毒干燥，在電子天平上稱重并記錄備用。去除齦溝液收集部分的齦上菌斑，棉球隔濕后氣槍輕吹待測牙面，1 min后將濾紙條插入患牙的觀察位點的齦溝，當有阻力時停止，滯留30 s后取出，放入Ep管立即稱重并與收集齦溝液前重量比較，算出齦溝液的重量（mg），按齦溝液密度等于1計算齦溝液量（mL）。在Ep管中加磷酸鹽緩沖液300 μL，震蕩1 h后取出濾紙條，將標本放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 主要儀器 -20 ℃普通冰箱，離心機（深圳愛特爾），全自動酶標儀（Bio-Tec）。

1.3.2 主 要 試 劑 HMGB1/HMG3/SBP-1/HMG1 （HMGB1）Elisa試劑盒購自江蘇省弗泰生物科技有限公司，貨號：HMGB2/HMGB（HMGB1）Elisa試劑盒購自江蘇省弗泰生物科技有限公司，貨號：HD-HMGB2；一氧化氮Griess Reagent法檢測試劑盒（NO）（貨號：S0021，公司：碧云天）。

1.3.3 ELISA檢測HMGB1和HMGB2在牙周炎齦溝液中的表達水平 96孔板第一排的8個孔作為標準孔，按以下濃度：1、5、10、20、30、40、50 μL滴入各標準孔，按50 μL/孔稀釋，第1排的最后一個孔滴入超純水作為空白對照，利用標準孔數(shù)據(jù)在Excel下建立標準曲線。將制備的齦溝液回復常溫后各樣品50 μL加入其余樣品孔，在37 ℃的恒溫箱中反應(yīng)90 min；預先制備的0.01 M PBS洗板3次，濾紙印干；加入一抗（HMGB1和HMGB2）100 μL，37 ℃恒溫箱中反應(yīng)60 min；0.01 M PBS再次洗板3次，每次浸泡4 min，濾紙印干；加入酶標液100 μL，37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min；0.01 M PBS洗板4次，每次浸泡3 min，濾紙印干；加入底物TMB 90 μL，置恒溫箱中37 ℃在暗處反應(yīng)11 min；每孔加入1滴終止液混勻，當藍色轉(zhuǎn)為黃色時上機檢測；酶標儀設(shè)定450 nm處測定吸光值。

1.3.4 齦溝液中一氧化氮的檢測 取出標準品（1 M NaNO2）和樣品（齦溝液）放置至室溫；將標準品按以下濃度加入標準孔：0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μM，并稀釋至50 μL/孔。在剩余的樣品孔中加入50 μL/孔的關(guān)節(jié)液樣品；取出Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ放置至室溫，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅱ；通過酶標儀測出各標準品及樣品孔的吸光度，通過標準品的吸光度繪制出標準曲線，并通過標準曲線及樣品孔的吸光度求出各樣品的NO濃度。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，其中兩組3個指標組間比較應(yīng)用單因素方差分析；作HMGB1和HMGB2與NO進行Spearman相關(guān)分析，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較 兩組HMGB1、HMGB2及NO組間比較作單因素方差分析，兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表示HMGB1、HMGB2及NO在牙周炎齦溝液中表達與正常人的齦溝液比較異常增高（P＜0.05），見表1。

2.2 CCL1與HMGB2和NO的相關(guān)分析 HMGB1與NO水平作Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.875 （P＜0.05），兩者呈正相關(guān)。HMGB2與NO水平作Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.848（P＜0.05），兩者呈正相關(guān)。

表1 兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較（±s）

表1 兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較（±s）

*與對照組比較，P＜0.05

NO （μmol/L）試驗組（n=106）784.94±210.13*824.11±172.72*185.52±55.79*對照組（n=58）126.86±75.53 110.73±53.38 27.33±19.35組別 HMGB1 （pg/mL）HMGB2 （pg/mL）

3 討論

牙周炎發(fā)病原因是由于牙周的齦溝液中炎癥因子的聚集與形成緊密相關(guān)。正?？谇恢挟a(chǎn)生的NO是由L-精氨酸在一氧化氮合酶的催化下生成L-瓜氨酸時釋放的。一些研究已證實NO對維持口腔內(nèi)正常菌群的平衡以及抗微生物感染有直接影響[5-6]。同時，適量的NO對牙周組織的健康及功能的正常發(fā)揮起著重要作用[7-8]。在牙周炎癥狀態(tài)下，血管內(nèi)皮素的含量顯著增高，NO的水平相應(yīng)增高來對抗血管內(nèi)皮素所造成的牙周組織小血管及微血管的強烈收縮，在此防御反應(yīng)過程中，過量產(chǎn)生的NO使擴血管因子與縮血管因子之間的關(guān)系失衡，通過活化多重級聯(lián)信號引發(fā)炎癥級聯(lián)瀑布反應(yīng)，促進炎癥發(fā)展[9-10]。因此NO在牙周炎發(fā)病過程中的炎癥作用已不言而喻。然而牙周炎的齦溝液中的炎癥改變是否與HMGB1、HMGB2的炎癥聚集有關(guān)？定量檢測牙周炎患者的齦溝液中HMGB1、HMGB2的含量是否可以作為牙周炎的診斷指標？目前為止尚未有報道肯定的回答以上兩個問題，以下將對以上兩個問題展開深入討論。

本實驗的研究證明，HMGB1、HMGB2及NO在牙周炎患者的齦溝液中表達較正?；颊咴龈撸梢哉f明HMGB1、HMGB2及NO均為牙周炎的炎癥因子之一，與其他報道結(jié)果基本相符[11-13]。從實驗數(shù)據(jù)上可發(fā)現(xiàn)，試驗組齦溝液中HMGB1、HMGB2及NO的表達數(shù)據(jù)均明顯高于對照組，更進一步的說明了HMGB1、HMGB2及NO與牙周炎的發(fā)病密切相關(guān)。對于健康人群的牙周齦溝液的檢測中可看出HMGB1、HMGB2 及NO的表達量相對較低，從過去的報道中可知[14-15]。這表明可能在低含量的HMGB1、HMGB2及NO情況下不會形成牙周炎。

由上述可知，NO因濃度不同而具有不同的生物學作用，低濃度時可擴血管、抗菌的作用，可促進口腔健康，而高濃度時可促牙周炎癥形成及牙周組織破壞的作用。本研究發(fā)現(xiàn)HMGB1和HMGB2與NO均成正相關(guān)關(guān)系，由此可表明HMGB1和HMGB2均可促進KOA的局部炎癥形成，進而可能參與牙周組織的破壞。

綜上所述，HMGB1和HMGB2可能是炎癥因子NO的協(xié)同作用因子，其可促進牙周局部炎癥形成。探討HMGB1和HMGB2拮抗劑進一步地了解HMGB1和HMGB2在牙周炎中的作用機制，更能為臨床治療牙周炎提供新的靶向治療方向。

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Expression and Significance of HMGB1，2 of the Gingival Crevicular Fluid of Periodontitis

/HAN Yonggang，CHEN Zhong-shou，HUANG Feng-yun.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：083-085

Objective：To investigate the correlation between HMGB1， HMGB2 and NO in the onset of periodontitis，to understand the possible biological role of HMGB1，HMGB2 in the pathogenesis of periodontitis.Method：160 patients with periodontitis in dental department from March 2012 to March 2014 were selected as the experimental group，in addition teeth healthy subjects in our hospital were selected as the control group.Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the expression of HMGB1，HMGB2 and NO in gingival crevicular fluid.The correlation of HMGB1，HMGB2 and NO were analyzed in the periodontitis of gingival crevicular fluid.Result：The experimental group compared with the control group had statistical significance in the HMGB1，HMGB2 and NO（P＜0.05）.It showed that HMGB1，HMGB2 and NO expression in periodontitis gingival crevicular fluid compared with normal people in gingival crevicular fluid were abnormal increased.Spearman correlation analyzed for the expression levels of HMGB1，HMGB2 and NO.The correlation coefficients were r=0.875，0.848（P＜0.05），positived correlation.Conclusion：HMGB1，HMGB2 is one of important inflammatory factors in periodontitis.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.027

2014-04-11） （本文編輯：歐麗）

2012年深圳市龍崗區(qū)科技項目（YS2013189）

①廣東省深圳市龍崗區(qū)南灣人民醫(yī)院 廣東 深圳 518114

韓永剛

【Key words】Periodontitis； Gingival crevicular fluid； High mobility protein； Nitric oxide

First-author’s address：Nanwan People’s Hospital of Longgang District in Shenzhen City，Shenzhen 518114，China