吳欣

（國(guó)家海洋局第三海洋研究所，廈門(mén) 361005）

滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)其內(nèi)生菌影響的研究

吳欣

（國(guó)家海洋局第三海洋研究所，廈門(mén) 361005）

Streptomyces sp. WXC菌株是從滑桃樹(shù)（Trewia nudiflora L.）種子中分離到的一株內(nèi)生菌。提取植物種子的化學(xué)成分，對(duì)其進(jìn)行溶劑分組，檢測(cè)各組分對(duì)內(nèi)生放線菌S. sp. WXC的生長(zhǎng)、代謝和活性化合物的影響，結(jié)果表明，滑桃樹(shù)種子水溶性提取物Water ext.對(duì)S. sp. WXC的生長(zhǎng)、次生代謝產(chǎn)物和活性化合物都有明顯的促進(jìn)作用。

滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分 Streptomyces sp. WXC菌株 活性化合物 化學(xué)防御

在生物間的各種相互作用中，生物的化學(xué)防御（共生化學(xué)防御）是特別有趣的，因?yàn)樗仁潜３稚镂锓N分布平衡的基本因素，也是促進(jìn)生物協(xié)同進(jìn)化的重要因素。共生通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移來(lái)影響基因庫(kù)，并且對(duì)次生代謝的進(jìn)化施加影響；更重要的是，共生微生物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物可能是共生微生物影響其宿主的一種重要適應(yīng)機(jī)制［1］。過(guò)去研究較多的是植物和土壤微生物的化學(xué)防御，例如，植物與固氮菌Frankia的相互關(guān)系［2］，而植物與其內(nèi)生放線菌的化學(xué)防御［3］，尤其是與鏈霉菌的化學(xué)防御研究得較少［4，5］?；覙?shù)（Trewia nudifloraL.）是大戟科滑桃樹(shù)屬植物，熱帶大喬木，該植物的主要化學(xué)成分為具有抗腫瘤活性的美登木素類(lèi)化合物［6-8］。Streptomycessp. WXC（S. sp. WXC）菌株是從滑桃樹(shù)種子中分離到的一株內(nèi)生鏈霉菌。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，

S. sp. WXC菌株在常見(jiàn)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌株生物量低，當(dāng)培養(yǎng)基中加入滑桃樹(shù)種子提取物后，菌株生長(zhǎng)良好，生物量明顯增加，菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性也隨之提高。因此，我們推測(cè)很可能是植物種子中的化學(xué)成分誘導(dǎo)S.sp. WXC菌株提高了生物量和活性化合物的產(chǎn)量。本研究提取植物種子的化學(xué)成分，對(duì)其進(jìn)行溶劑分組，檢測(cè)各組分對(duì)內(nèi)生放線菌S. sp. WXC的生長(zhǎng)、代謝和活性化合物的影響，旨在探究滑桃樹(shù)種子化學(xué)成分對(duì)其內(nèi)生菌S.sp. WXC菌株的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

滑桃樹(shù)（T. nudifloraL.）種子由云南西雙版納植物園提供。

分析純級(jí)石油醚、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇，色譜級(jí)甲醇，無(wú)水Na2SO4均購(gòu)于英杰生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 滑桃樹(shù)內(nèi)生菌S. sp. WXC菌株的分離和保藏S. sp. WXC菌株是由滑桃樹(shù)無(wú)菌苗中分離到的一株內(nèi)生菌。用含有赤霉素（1 mg/mL）的瓊脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)滑桃樹(shù)無(wú)菌苗，當(dāng)其生長(zhǎng)到5-6 cm時(shí)，將其切成5 mm的片段，置于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)分離得到WXC菌株。該菌株的形態(tài)特征和GenBank序列比對(duì)結(jié)果表明，該菌株屬于鏈霉菌屬（Streptomycessp.）。菌株置于10%甘油中，密封于安培管中，-70℃保藏。

1.2.2 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分的提取 將滑桃樹(shù)種子去殼，稱(chēng)重得100 g，研磨成細(xì)小的碎塊，用石油醚浸泡，在50℃水浴中加熱大約2 h，待冷卻后過(guò)濾，共提取3次，獲得石油醚提取液，減壓回收溶劑，獲得石油醚提取物1（PE ext.1）。將石油醚加熱回流提取過(guò)濾后獲得的種子殘?jiān)靡宜嵋阴ゼ訜峄亓魈崛〔⑦^(guò)濾，方法同前，提取3次，獲得乙酸乙酯提取液，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯提取物。用石油醚∶甲醇＝1∶1對(duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行萃取，獲得甲醇提取物1（MeOH ext.1）和石油醚提取物2（PE ext.2），將PE ext.1和PE ext.2合并得到石油醚提取物（PE ext.）。將經(jīng)過(guò)石油醚和乙酸乙酯加熱回流提取后的種子殘?jiān)?0%的甲醇進(jìn)行加熱回流提取，重復(fù)3次，獲得稀甲醇提取液，減壓回收溶劑，得到甲醛提取物2（MeOH ext.2）。將MeOH ext.1和MeOH ext.2合并，減壓回收溶劑，并用乙酸乙酯∶水＝1∶1萃取3次，得到乙酸乙酯萃取液和水相。在乙酸乙酯萃取液中加入過(guò)飽和的無(wú)水Na2SO4，靜置、過(guò)濾后，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯提取物（EA ext.）。水相部分用等體積正丁醇萃取3次，獲得正丁醇萃取液和水相，分別減壓回收溶劑，得到正丁醇提取物（Bu ext.）和水溶液提取物（Water ext.）。將PE ext.、EA ext.、Bu ext.和Water ext.定容至250 mL溶液中，每組分濃度相當(dāng)于400 mg/mL滑桃樹(shù)種子的濃度。

1.2.3 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S.sp. WXC菌株生長(zhǎng)狀態(tài)的影響 蘸取S.sp. WXC菌株的孢子于10 mL無(wú)菌水中，制成菌懸液，將菌懸液涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，用微量注射器分別吸取25 μL的化學(xué)組分（EA ext.，Bu ext.，Water ext.）于紙片上，待紙片吹干后，平鋪于培養(yǎng)基上，并用空白的紙片作對(duì)照（blank control），將平板置于28℃培養(yǎng)10 d，觀察菌株生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.4 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S. sp. WXC菌株生物量的影響 在100 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)基中分別加入250 μL滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分（EA ext.，Bu ext.，Water ext.），將S.sp. WXC菌株接種在添加了滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分的高氏一號(hào)培養(yǎng)基和未添加任何化學(xué)組分的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中分別進(jìn)行培養(yǎng)，在28℃，180 r/min的條件下，分別培養(yǎng)3、4、5和6 d。根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間收菌，4℃，6 000 r/min，15-20 min，菌體經(jīng)過(guò)冷凍抽干后，稱(chēng)菌體干重。以上每個(gè)樣品分別作3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 不同濃度的滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分與S. sp. WXC菌液濃度的關(guān)系 將不同濃度的滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分加入高氏一號(hào)培養(yǎng)基中（終濃度分別為0、1、5、25、125、250、500和1 000 μg/mL），將S.sp. WXC菌株接種到培養(yǎng)基中，于28℃，180 r/min，培養(yǎng)48 h。通過(guò)檢測(cè)菌體的OD600值判斷滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分的濃度與菌液濃度的關(guān)系。以上每個(gè)樣品分別作3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S.sp. WXC菌株次生代謝產(chǎn)物的影響 在100 mL高氏一號(hào)培養(yǎng)基中分別加入250 μL滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分（EA ext.，Bu ext.，Water ext.），將S.sp. WXC菌株接種在添加了滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分的高氏一號(hào)培養(yǎng)基和未添加任何化學(xué)組分的高氏一號(hào)培養(yǎng)基中分別進(jìn)行培養(yǎng)，在28℃，180 r/min的條件下，分別培養(yǎng)3、4、5和6 d。根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間，收集菌體，4℃，6 000 r/min，15-20 min，上清用等體積乙酸乙酯萃取2遍，濃縮得到胞外的乙酸乙酯相；菌體經(jīng)過(guò)冷凍抽干后，用乙酸乙酯提取得到胞內(nèi)的乙酸乙酯相。以上每個(gè)樣品分別作3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S.sp. WXC菌株活性化合物的影響 對(duì)胞內(nèi)和胞外的乙酸乙酯相，分別用HPLC技術(shù)來(lái)檢測(cè)其中活性成分frenolicin B的含

量。以純品frenolicin B作為標(biāo)準(zhǔn)樣，分別取3、6、12、25和50 μg 上樣，洗脫劑為甲醇∶水（60∶40），洗脫條件為1 mL/min，27℃。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)制作frenolicin B的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將胞內(nèi)和胞外的乙酸乙酯相分別經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)，洗脫劑為甲醇∶水（60∶40），洗脫條件為1 mL/min，27℃。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出各樣品中frenolicin B的含量，frenolicin B的產(chǎn)量與S.sp. WXC菌株的生物量的比值，即為frenolicin B的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S. sp. WXC菌株生長(zhǎng)和生物量的影響

本研究在前期試驗(yàn)現(xiàn)象基礎(chǔ)上，提取了滑桃樹(shù)種子的化學(xué)成分，根據(jù)成分的化學(xué)極性，對(duì)其進(jìn)行溶劑分組，排除組分PE ext.（主要為常見(jiàn)的脂溶性化學(xué)成分），通過(guò)紙片法研究滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分（Water ext.、EA ext.和Bu ext.）對(duì)S.sp. WXC菌株生長(zhǎng)狀態(tài)的影響。結(jié)果（圖1）表明，位于Water ext.紙片周?chē)木晟L(zhǎng)較多且緊密，其次為Bu ext.，EA ext.對(duì)菌株生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的作用，說(shuō)明滑桃樹(shù)種子中的水溶性物質(zhì)對(duì)S.sp. WXC菌株的生長(zhǎng)起到明顯的促進(jìn)作用。

圖1 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S. sp. WXC菌株生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

除此以外，與不加種子化學(xué)成分的培養(yǎng)條件相比，S.sp. WXC菌株在添加種子化學(xué)成分后，菌株生物量發(fā)生了較大的變化，從3、4、5和6 d的數(shù)據(jù)來(lái)看，添加Water ext.的菌株干重幾乎是不添加時(shí)的3倍（圖2）。Bu ext.對(duì)菌株干重的影響次之，EA ext.對(duì)菌株干重并沒(méi)有明顯的作用。該結(jié)果進(jìn)一步確定了滑桃樹(shù)種子的水溶性成分能刺激菌體生長(zhǎng)。而且S.sp. WXC的菌液濃度隨著Water ext.濃度的提高而升高，當(dāng)Water ext.濃度在1-25 μg/mL時(shí)，菌株WXC的菌液濃度急劇上升，但在125-1 000 μg/mL時(shí)，菌液濃度增加較為平緩（圖3）。

圖2 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S. sp. WXC菌株生物量的影響

圖3 不同濃度Water ext.對(duì)S. sp. WXC菌液濃度的影響

2.2 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S.sp. WXC菌株次生代謝產(chǎn)物的影響

從S.sp. WXC菌株胞內(nèi)和胞外次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量來(lái)看，滑桃樹(shù)種子的Water ext.對(duì)胞外的產(chǎn)物有明顯的促進(jìn)作用，相比之下，Bu ext.和EA ext.對(duì)胞外的產(chǎn)物沒(méi)有明顯的作用。在第3天添加Water ext.的菌株胞外次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量與不加種子成分的菌體產(chǎn)量一致，但在菌體的指數(shù)生長(zhǎng)期，添加Water ext.的菌株胞外次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量逐漸增加，到第6天產(chǎn)量幾乎是不添加種子成分的2-3倍（圖4）?？梢?jiàn)，種子的水溶性提取物對(duì)S.sp. WXC菌株胞外的次生代謝產(chǎn)物有明顯的誘導(dǎo)作用，而對(duì)胞內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物無(wú)明顯作用。

圖4 滑桃樹(shù)種子Water ext.對(duì)S. sp. WXC菌株次生代謝產(chǎn)物的影響

2.3 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)S.sp. WXC菌株活性化合物的影響

從3-6 d HPLC的檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，添加了Water ext.的fenolicin B的產(chǎn)量逐漸增加，而B(niǎo)u ext.和EA ext.對(duì)fenolicin B的產(chǎn)量影響并不大。在第6天時(shí)，添加了Water ext.的fenolicin B的產(chǎn)量達(dá)到不添加Water ext.的3倍左右，說(shuō)明滑桃樹(shù)種子的水溶性提取物誘導(dǎo)內(nèi)生菌提高了活性化合物fenolicin B的產(chǎn)量。

圖5 滑桃樹(shù)種子化學(xué)組分對(duì)fenolicin B產(chǎn)量的影響

3 討論

S.sp. WXC菌株是從滑桃樹(shù)種子中分離到的一株內(nèi)生菌，在長(zhǎng)期與宿主植物相互作用的過(guò)程中，S.sp. WXC菌株已經(jīng)適應(yīng)了植物的內(nèi)生小環(huán)境，當(dāng)將它從植物中分離出來(lái)，并培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上時(shí)，其生長(zhǎng)速度緩慢。大部分不可培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的內(nèi)生菌也出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象，較為典型的如菌株Frankia，在人工培養(yǎng)時(shí)，與大多數(shù)自由生長(zhǎng)的細(xì)菌相比，該菌的生長(zhǎng)非常緩慢，并且呈現(xiàn)出各種不同的形態(tài)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，滑桃樹(shù)的種子水溶性提取物Water ext.對(duì)S.sp. WXC菌株的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，并且菌株的生物量隨著Water ext.濃度的升高而提高。Water ext.對(duì)S.sp. WXC菌株的次生代謝產(chǎn)物也有明顯的促進(jìn)作用，誘導(dǎo)菌株提高了主要活性化合物fenolicin B的產(chǎn)量?；覙?shù)種子的化學(xué)組分Water ext.、Bu ext.和EA ext.的分子極性由大到小，各組分對(duì)S.sp. WXC菌株的影響程度中Water ext.最明顯，EA ext.對(duì)菌株的影響不明顯，說(shuō)明對(duì)S.sp. WXC菌株有誘導(dǎo)作用的植物成分是分子極性比較大的物質(zhì)，很可能是水溶性的成分。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究對(duì)其內(nèi)生菌S.sp. WXC有影響的滑桃樹(shù)種子化學(xué)成分奠定了基礎(chǔ)。

滑桃樹(shù)水溶性化學(xué)組分對(duì)S.sp. WXC菌株的活性化合物fenolicin B的影響，說(shuō)明了S.sp. WXC菌株作為滑桃樹(shù)的內(nèi)生菌，在與植物宿主的長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)產(chǎn)生具有抑制真菌活性的物質(zhì)，形成了共生化學(xué)防御，并且這種活性物質(zhì)可以被植物宿主所誘導(dǎo)。植物與土壤微生物的化學(xué)防御機(jī)制主要應(yīng)用于生物防治。由于植物內(nèi)生菌分布于植物的不同組織中，有充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)受到植物組織的保護(hù)，不受外部惡劣環(huán)境如強(qiáng)烈日光、紫外線、風(fēng)雨等的影響，具有穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境。因此，相對(duì)于附生菌內(nèi)生菌更易于發(fā)揮生防作用［10］。而且植物內(nèi)生菌可以直接面對(duì)病菌的侵染，通過(guò)降解病菌菌絲、產(chǎn)生拮抗物質(zhì)或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性抑制病原物，對(duì)病菌的致病因子或病菌本身發(fā)起攻擊，而植物本身的基因并未發(fā)生改變，仍然可以保持植物的天然性狀［11］。因此，植物內(nèi)生放線菌是植物病害生物防治的天然資源菌，具有廣闊的理論研究?jī)r(jià)值和開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

主要研究滑桃樹(shù)種子不同化學(xué)組分對(duì)其內(nèi)生菌Streptomycessp. WXC生長(zhǎng)、代謝和活性化合物的影響。結(jié)果表明，滑桃樹(shù)種子水溶性提取物Water ext.對(duì)S. sp. WXC的生長(zhǎng)、次生代謝產(chǎn)物甚至是活性化合物都有明顯的促進(jìn)作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Research on the Influence of Trewia nudiflora Seed Chemical Components on Its Endophyte

Wu Xin
（Third Institute of Oceanography State Oceanic Administration，Xiamen 361005）

Streptomyces sp. WXC was an endophytic strain isolated from the seed of Trewia nudiflora. Trewia nudiflora seed chemical components were extracted and classified. The results showed that the production of frenolicin B was induced by the addition of the Water ext., which was correlated to the upregulation of growth and secondary metabolites. Therefore, we speculated that the inducible production of the antifungal frenolicin B may be an important adaptation mechanism allowing the symbiont, S. sp. WXC, to affect its host, T. nudiflora, through the function of symbiotic chemical defense.

Trewia nudiflora seed chemical components Streptomyces sp. WXC Active compound Chemical defence

2013-12-03

吳欣，女，博士，工程師，研究方向：微生物學(xué)；E-mail：careless78@gmail.com