劉志強(qiáng) 陳潔 邱高峰

（上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

中華絨螯蟹EsSox21b-like基因干擾載體的構(gòu)建及原核表達(dá)制備dsRNA

劉志強(qiáng) 陳潔 邱高峰

（上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

Sox（SRY-related HMG-box）基因是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在動(dòng)物的性別分化與決定、器官的發(fā)生等方面具有重要的調(diào)控作用。旨在利用RNA干擾技術(shù)證實(shí)該基因的功能，將EsSox21b-like基因617 bp的片段克隆至含有兩個(gè)T7啟動(dòng)子的L4440載體上，構(gòu)建了EsSox21b-like-L4440干擾載體，將該重組載體轉(zhuǎn)化至RNaseⅢ缺陷型的HT115菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌株體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，獲得了EsSox21b-like正義和反義單鏈RNA，經(jīng)過(guò)變性、退火形成大量雙鏈RNA（EsSox21b-like-dsRNA），能滿(mǎn)足以后應(yīng)用RNA干擾試驗(yàn)對(duì)于EsSox21b-like基因功能的研究。

中華絨螯蟹 RNA干擾 L4440 HT115 原核表達(dá) dsRNA

1990年，Sinclair等［1］克隆獲得人類(lèi)Y 染色體上的性別決定基因 SRY（Sex-determining region of Y chromosome，SRY）。隨后其他研究者在哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、節(jié)肢動(dòng)物等物種［2-7］克隆獲得了許多與SRY基因同源的基因，被命名為Sox基因（SRY-related HMG-box gene）［8］。不同物種的Sox基因編碼的蛋白質(zhì)均具有一個(gè)保守的HMG盒［9］，能與特定DNA序列相結(jié)合，調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄。亦已證明，Sox基因作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在動(dòng)物性別決定、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、軟骨的發(fā)生、胸腺細(xì)

胞的發(fā)育、腫瘤細(xì)胞的發(fā)生等方面具有重要的調(diào)控作用［10，11］。之前，我們從中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）分離鑒定了一個(gè)只在性腺中特異性表達(dá)的EsSox21b-like基因［12］，推測(cè)該基因可能在中華絨螯蟹性腺分化與發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是一種高效、特異性沉默同源mRNA的敲減工具，可阻斷靶基因表達(dá)［13］，是研究基因功能［14］的有效方法，而獲得能使目的RNA降解的dsRNA是實(shí)施RNA干擾技術(shù)的前提［15］。目前合成dsRNA主要是通過(guò)商業(yè)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成或者利用原核體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成兩種方式［16，17］。利用商業(yè)試劑盒合成dsRNA成本高、合成量小，所以該方法合成的dsRNA多用于線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅等一些小的模式生物的研究。對(duì)于一些經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、個(gè)體大的物種來(lái)說(shuō)，要導(dǎo)入大量的dsRNA才能起到一定的干擾效果，因此，商業(yè)試劑盒合成dsRNA不能滿(mǎn)足這些物種科研或生產(chǎn)的需要。與利用商業(yè)轉(zhuǎn)錄試劑盒相比，原核體內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成dsRNA的方式經(jīng)濟(jì)高效。目前，通過(guò)該方法獲得的dsRNA已被成功運(yùn)用于果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)、昆蟲(chóng)等一些生物的基因功能研究中［18-24］，而在水產(chǎn)物種中僅有對(duì)蝦［25］等少數(shù)物種的基因功能研究使用了原核體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得的dsRNA。本研究將中華絨螯蟹EsSox21b-like基因617 bp的片段插入至L4440載體的兩個(gè)T7啟動(dòng)子之間，構(gòu)建EsSox21b-like-L4440干擾載體（圖1）。將該重組載體轉(zhuǎn)化至RNaseⅢ缺陷性的HT115菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，菌株體內(nèi)轉(zhuǎn)錄EsSox21b-like基因正義鏈和反義鏈RNA，經(jīng)過(guò)變性、退火獲得EsSox21b-like-dsRNA，旨在為以后利用RNA干擾技術(shù)研究EsSox21b-like基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中華絨螯蟹購(gòu)自上海臨港新城果園農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，用于提取卵巢的RNA；載體L4440與菌株HT115為美國(guó)線(xiàn)蟲(chóng)遺傳中心饋贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 卵巢RNA提取及cDNA第一鏈的合成 根據(jù)RNAiso Plus（TaKaRa，Japan）說(shuō)明書(shū)提供的操作步驟提取中華絨螯蟹卵巢RNA。提取的RNA經(jīng)DNA酶處理去除DNA的污染后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海天根生物技術(shù)公司）合成cDNA第一鏈。

圖1 干擾載體構(gòu)建流程

1.2.2 RNA干擾片段的選定與引物設(shè)計(jì) 利用si-RNA在線(xiàn)分析軟件對(duì)中華絨螯蟹的EsSox21b-like基因進(jìn)行分析，并結(jié)合基因結(jié)構(gòu)域和保守位點(diǎn)選取有效的干擾片段。根據(jù)對(duì)選擇的617 bp的靶序列片段和L4440質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析設(shè)計(jì)引物。引物序列：EsSox21b-likeF：5'-tccccgcggTGCCACCAAGAAGGAGGAC-3'；EsSox21b-likeR：5'-ggactagtGCAAGGACGACGCTGACT-3'。利用設(shè)計(jì)的引物和反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得目的片段。

1.2.3 重組體的構(gòu)建 PCR獲得的目的片段和L4440載體用限制性?xún)?nèi)切酶SpeI和SacII（Promega）進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和割膠純化后連接過(guò)夜。

1.2.4 陽(yáng)性克隆的篩選 將重組載體L4440+EsSox-21b-like轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115感受態(tài)，然后涂布到選擇性固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。通過(guò)菌落PCR、雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，并將篩選的菌液送測(cè)序公司（美吉測(cè)序，上海）測(cè)序。

1.2.5 dsRNA的合成 將測(cè)序正確的含L4440+Sox重組質(zhì)粒的HT115菌株，接種到4 mL含氨芐和四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基上過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)。分別取300

μL擴(kuò)大培養(yǎng)的菌株接種到30 mL的2×YT培養(yǎng)基上，37℃震蕩培養(yǎng)至OD595=0.5左右，加入57.6 μL（50 mg/mL）的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h左右。

利用Trizol法提取誘導(dǎo)后培養(yǎng)菌株的RNA，提取的RNA經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性。用RQ1 RNase-Free DNase處理，去除可能混有的DNA，然后72℃水浴變性10 min，自然冷卻至室溫，退火形成dsRNA。加RNaseA檢驗(yàn)退火是否得到dsRNA。通過(guò)瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)對(duì)得到的dsRNA進(jìn)行檢測(cè)和濃度測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 重組載體的構(gòu)建

提取的中華絨螯蟹卵巢RNA經(jīng)RQ1 RNase-Free DNase去除DNA的干擾。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA的第一鏈，以cDNA的第一鏈為模板，F(xiàn)1和R1為引物PCR克隆獲得EsSox21b-like基因的部分片段。如圖2-A可知，獲得的目的片段與預(yù)期的片段大小（617 bp）吻合。利用限制性?xún)?nèi)切酶SpeI和SacII對(duì)PCR產(chǎn)物和載體L4440進(jìn)行雙酶切，電泳檢測(cè)酶切效果如圖2-B所示。

圖2 EsSox21b-like基因PCR產(chǎn)物（A）及目的片段和L4440雙酶切驗(yàn)證（B）

2.2 陽(yáng)性菌落的篩選

如圖3-A所示，用T7單引物（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）對(duì)在選擇性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行篩選時(shí)，得到其菌落PCR產(chǎn)物，包括插入的617 bp的目的片段和質(zhì)粒L4440兩個(gè)T7啟動(dòng)子之間的部分序列，其大小約為800 bp；而對(duì)L4440空質(zhì)粒進(jìn)行的PCR僅僅擴(kuò)增質(zhì)粒L4440兩個(gè)T7啟動(dòng)子之間的序列，產(chǎn)物大小約為200 bp。經(jīng)過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒用SpeI和SacII進(jìn)行雙酶切后獲得了與目的片段大小（617 bp）一樣的酶切片段（圖3-B）。進(jìn)一步對(duì)選擇性培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果和目的序列也完全吻合，說(shuō)明目的片段已成功地插入到載體L4440上。

圖3 重組載體菌落PCR（A）及雙酶切（B）檢測(cè)

2.3 原核表達(dá)制備EsSox21b-like-dsRNA

提取經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后和未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株的RNA，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株RNA相比，經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的菌株的RNA包括轉(zhuǎn)錄的600 bp的目的片段和質(zhì)粒L4440兩個(gè)T7啟動(dòng)子之間的部分序列，大小約為800 bp（圖4-A）。經(jīng)過(guò)RQ1 RNase- Free DNase處理、72℃水浴變性、然后退火冷卻至室溫，最后經(jīng)RNase處理該條帶仍清晰可見(jiàn)（圖4-B）。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，溶解于100 μL去離子水中的dsRNA濃度為5 837

μg/mL。

圖4 原核表達(dá)制備的EsSox21b-like-dsRNA

3 討論

dsRNA的制備是實(shí)施RNA干擾試驗(yàn)的條件，一種操作簡(jiǎn)單，低成本制備dsRNA的方法可以便于RNAi在相關(guān)研究中的應(yīng)用。目前常用制備dsRNA的方法有2種，體外轉(zhuǎn)錄法和體內(nèi)載體表達(dá)法。與利用商業(yè)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄相比，細(xì)菌體內(nèi)載體表達(dá)可以經(jīng)濟(jì)高效的制備dsRNA?？墒?，構(gòu)建干擾表達(dá)載體通常需要3步克隆實(shí)現(xiàn)［26］，雖然在研究斑節(jié)對(duì)蝦kazal型蛋白激酶抑制劑基因功能時(shí)，梁艷等［25］利用商業(yè)載體pGMT和pGRIVE通過(guò)2步克隆的方式成功的構(gòu)建了干擾表達(dá)載體，但多步克隆帶來(lái)的繁瑣操作依然不可避免。L4440具有兩個(gè)T7啟動(dòng)子［27］，只需一步克隆，將目的片段插入到兩個(gè)啟動(dòng)子之間就可成功的構(gòu)建出干擾表達(dá)載體。并且，L4440具有兩個(gè)相同的啟動(dòng)子，因此，在IPTG誘導(dǎo)時(shí)能轉(zhuǎn)錄獲得幾乎等量的正義鏈和反義鏈的RNA，從而使得在變性退火時(shí)有足夠的正義或反義鏈RNA與其互補(bǔ)鏈退火形成dsRNA。

正義和反義鏈RNA的濃度對(duì)變性退火制備dsRNA時(shí)有非常重要的影響，當(dāng)對(duì)低濃度的正義鏈和反義鏈RNA進(jìn)行處理時(shí)很難獲得dsRNA或者獲得的量很低，當(dāng)增加正義鏈和反義鏈RNA的濃度時(shí)便能高效地獲得dsRNA。這可能是由于經(jīng)過(guò)變性處理的低濃度的正義鏈和反義鏈RNA，在還未“尋找”到與之互補(bǔ)的RNA鏈時(shí)便自身發(fā)生鏈內(nèi)互補(bǔ)序列的退火結(jié)合，高濃度的RNA在退火時(shí)與互補(bǔ)鏈RNA結(jié)合的概率要高于自身互補(bǔ)結(jié)合的概率。HT115菌株是一種RNaseIII缺陷型菌株，因此通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的EsSox21b-like基因片段的RNA不會(huì)被降解，能夠大量保存下來(lái)，這就在濃度上保證了變性后的RNA能夠順利地互補(bǔ)結(jié)合形成dsRNA。另外，合理地選擇培養(yǎng)基也能夠有效地提高正義鏈和反義鏈RNA的濃度。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)選用加氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基，誘導(dǎo)表達(dá)后，正義鏈和反義鏈RNA濃度很低。改用不加氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基后，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)，能夠獲得高濃度的正義鏈和反義鏈RNA。這可能是由于加入抗生素后，細(xì)菌要把更多的物質(zhì)和能量用于合成適應(yīng)氨芐青霉素環(huán)境的物質(zhì)，而影響了轉(zhuǎn)錄合成目的基因正義鏈和反義鏈RNA。

本試驗(yàn)通過(guò)原核體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的方式僅需要培養(yǎng)30 mL的菌株便能獲得約0.5 mg/次的EsSox21blike-dsRNA，而商業(yè)轉(zhuǎn)錄試劑盒合成dsRNA時(shí)，最高產(chǎn)量為0.03 mg/次（RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems—SP6 and T7使用說(shuō)明書(shū)）?？梢?jiàn)利用本試驗(yàn)方法能高效獲得dsRNA，僅需花費(fèi)少量的資金和時(shí)間即能合成足量的EsSox21b-like-dsRNA用于研究EsSox21b-like基因的功能。

4 結(jié)論

將中華絨螯蟹EsSox21b-like基因617 bp的目的片段克隆至L4440載體上，構(gòu)建了能夠在原核體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出目的片段正義鏈和反義鏈RNA的干擾表達(dá)載體，并且通過(guò)對(duì)獲得的目的片段正義鏈和反義鏈RNA進(jìn)行變性、退火處理，制備了可用于以后RNA干擾試驗(yàn)的EsSox21b-like-dsRNA。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction of Interference Vector of EsSox21b-like Gene from Chinese Mitten Crab（Eriocheir sinensis）and Preparation of dsRNA by Prokaryotic Expression

Liu Zhiqiang Chen Jie Qiu Gaofeng
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Sox（SRY-related HMG-box）gene is a kind of important transcription factor, which functions in sex determination, organogenesis, etc. The gonad-specific expression of this novel gene suggested that it might play an important role in the development of gonad. To determine the exact role of EsSox21b-like gene using RNA interference, a EsSox21b-like-L4440 interference vector was successfully constructed for production of large amount of dsRNA. The target sequence of EsSox21b-like gene was inserted into the L4440 vector containing two T7 promoters. Then the recombinant plasmid was transformed into HT115 bacteria, a RNaseⅢ deficient strain. A large amount of EsSox21blike sense and antisense RNAs was simultaneously transcripted in vivo when induced by IPTG. After denatured and annealed, EsSox21b-like double strand RNAs（dsRNAs）were produced and the yield of EsSox21b-like-dsRNA was enough for future RNA interference experiment on the role of EsSox21b-like gene.

Eriocheir sinensis RNA interference L4440 HT115 Prokaryotic expression dsRNA

2013-11-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272655），國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD26B04），上海市科委基礎(chǔ)重點(diǎn)科研項(xiàng)目（11JC1404600），上海高校水產(chǎn)學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（B5005120001）

劉志強(qiáng)，男，碩士，研究方向：中華絨螯蟹生殖與發(fā)育；E-mail：liu503212225@sohu.com

邱高峰，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：蝦蟹分子遺傳與繁殖；E-mail：gfqiu@shou.edu.cn