李少杰，侯寶華，區(qū)金銳

1．南方醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州510515;2．廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)普通外科

胰腺癌是一種惡性程度高、預(yù)后極差的腫瘤，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升。近20年以來(lái)，胰腺癌的發(fā)病率在美國(guó)增加了3倍，我國(guó)增加了6倍［1］。手術(shù)切除是目前唯一能使胰腺癌得到根治的方法，但由于胰腺癌患者早期缺乏特異的臨床癥狀和體征，以及礙于目前檢測(cè)手段的限制，大部分該病患者在就診時(shí)已到晚期，并且其對(duì)放化療都不敏感，從而失去了可能手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，總體5年生存率低于3%［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2011年美國(guó)胰腺癌的新發(fā)病中約四分之三以上死于胰腺癌，發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)幾乎相等［3］。雖然胰腺癌的發(fā)病機(jī)制未完全明確，但人們已經(jīng)證明其發(fā)生發(fā)展過(guò)程的重要分子學(xué)表現(xiàn)是一系列信號(hào)通路和重要基因的改變。因此，從胰腺癌分子生物學(xué)和病理生理角度進(jìn)行深入研究，對(duì)預(yù)防胰腺癌、尋找特異的腫瘤標(biāo)志物和新的靶向治療點(diǎn)具有重要意義。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)許多miRNA參與了胰腺癌的生物調(diào)控，間接地發(fā)揮著抑癌基因和致癌基因的作用。

1 m icroRNA簡(jiǎn)介

自從Lee等［4］在1993年利用遺傳分析的方法發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miRNA(lin-4)之后，miRNA從此受到了廣泛的關(guān)注。2002年，Calin等［5］對(duì)其開(kāi)創(chuàng)性的研究成果報(bào)道，使miRNA成為腫瘤研究中的新焦點(diǎn)。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，它在物種進(jìn)化中比較保守，其組織和細(xì)胞的功能特異性是由組織的特異性和時(shí)序性所決定。miRNA基因產(chǎn)生的初級(jí)產(chǎn)物primiRNA在核內(nèi)被切割，形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miRNA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下，從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被Dicer酶切割成雙鏈的miRNA，然后解鏈產(chǎn)生成熟的miRNA分子［6］。miRNA的多樣性與保守性決定了其在生理、生化功能上的重要性與普遍性。在生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，miRNA在調(diào)控基因表達(dá)方面尤為重要:miRNA發(fā)揮功能主要依賴與其靶基因3'非翻譯區(qū)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)而誘導(dǎo)靶向mRNA的降解或者抑制靶向mRNA的翻譯，從而影響靶蛋白的表達(dá)水平，但不影響miRNA的穩(wěn)定性;除此之外，多個(gè)miRNA可以共同調(diào)控同一基因，同時(shí)單個(gè)miRNA可以有很多個(gè)靶基因，這也說(shuō)明miRNA可能影響所有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前研究已發(fā)現(xiàn)了上萬(wàn)種miRNAs，其中屬于人類的已超過(guò)千條miRNAs。

許多惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但其發(fā)生發(fā)展過(guò)程均與一些基因的改變相關(guān)，基因改變主要體現(xiàn)在原癌基因的激活、抑癌基因突變而失活、生長(zhǎng)因子及或其受體的表達(dá)上調(diào)，而miRNAs能夠調(diào)控該基因的功能，從而起到影響腫瘤發(fā)生的作用。

2 m icroRNA與胰腺癌

循環(huán)中miRNA能夠穩(wěn)定存在于血液中而游離于細(xì)胞之外，其在循環(huán)或組織中的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)與多種惡性腫瘤的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，此外，miRNA作為一個(gè)微調(diào)分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，在疾病發(fā)展階段起到的作用越發(fā)顯著。

2．1 循環(huán)中m iRNA與胰腺癌 Valadi等［7］首次證明可從血清中提取并確定游離miRNA的含量。Chen等［8］通過(guò)運(yùn)用先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miRNA占血清中小分子RNA的絕大部分比重，而且這些小分子RNA具有耐酸堿、抗RNA酶及抗物理化學(xué)處理的穩(wěn)定性。Zerecke等［9］研究了微泡中miR-126的功能，首次正面回答了循環(huán)中miRNA是否具有生物學(xué)活性的問(wèn)題。循環(huán)中的miRNA主要由組織細(xì)胞主動(dòng)分泌，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步被脂蛋白或脂質(zhì)包被形成外切酶體(Exosome)，這一過(guò)程使成熟的miRNA初現(xiàn)，后經(jīng)細(xì)胞分泌進(jìn)入血液，外切酶體去掉包被，釋放出miRNA發(fā)揮其生物學(xué)功能。在健康人的血清中，miRNA的表達(dá)基本無(wú)異常，但是當(dāng)人體存在惡性腫瘤時(shí)，血清miRNA的表達(dá)會(huì)發(fā)生明顯變化。

在胰腺癌患者循環(huán)中顯著上調(diào)的基因有miR-16、20a、21、24、25、99a、155、185、191、210、196a、451等。Wang等［10］發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血漿中miR-210、miR-21、miR-196a、miR-155表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步分析這4種miRNA聯(lián)合檢測(cè)作為區(qū)分胰腺癌與正常人群標(biāo)志物的診斷靈敏度可達(dá)64%，特異度可達(dá)89%，其中miR-155的表達(dá)水平在胰腺癌形成的早期就明顯升高，而miR-196a的表達(dá)高低和患者病程發(fā)展密切相關(guān)。Wei等［11］發(fā)現(xiàn)，非胰腺癌患者血清miR-16、miR-196a的表達(dá)明顯低于胰腺癌患者，而且將腫瘤標(biāo)志物CA19-9與循環(huán)中miR-196a、miR-16聯(lián)合檢測(cè)，可以使胰腺癌診斷的特異性和敏感性分別提高到92．0%和95．6%。Kong等［12］研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)無(wú)法切除的胰腺導(dǎo)管腺癌患者血漿miRNA-196a水平明顯高于可以手術(shù)治療的患者。Liu等［13］報(bào)道血漿中miR-451的表達(dá)水平在胰腺癌病例組和健康對(duì)照組中存在差異，在胰腺癌病例組的血漿中顯著上調(diào)，并利用7種血清miRNA(miR-20a、miR-21、miR-24、miR-25、miR-99a、miR-185、miR-191)共同作為診斷標(biāo)志物的準(zhǔn)確率高于現(xiàn)行常規(guī)檢測(cè)所使用的CA19-9和CEA的準(zhǔn)確率。而且這7種miRNA在I期胰腺癌患者血清中的表達(dá)量大于正常人血清中表達(dá)量。Li等［14］檢測(cè)了正常人和胰腺惡性組循環(huán)中miRNA-200a、miRNA-200b的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-200a和miRNA-200b的表達(dá)在二者的循環(huán)中存在顯著性差異，與胰腺惡性組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。在未來(lái)研究中，將進(jìn)一步探索循環(huán)中miRNA來(lái)預(yù)測(cè)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，為闡述和驗(yàn)證胰腺癌具體的發(fā)生發(fā)展機(jī)制和胰腺癌分子靶向治療尋找新的突破口。

2．2 組織中m icroRNA與胰腺癌 最近研究表明，在胰腺癌中超過(guò)100種miRNA異常表達(dá)，并且超過(guò)50%的miRNA編碼基因位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)。miRNA在腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性且異常表達(dá)，在不同腫瘤組織中miRNA具有不同的表達(dá)譜。由此可推斷miRNA可能成為胰腺癌早期診斷的新分子標(biāo)志物，并對(duì)胰腺癌的發(fā)生進(jìn)展起到類似癌基因或抑癌基因的作用。

研究發(fā)現(xiàn)miR-196a、miR-21、miR-27a、miR-155、miR-10b等在胰腺癌中高表達(dá)，而這些高表達(dá)的miRNA可能與促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)，起到癌基因的作用。Szafranska等［15-16］研究指出，miRNA-196a等僅在胰腺癌中表達(dá)異常，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA-196a在正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞、正常胰腺腺泡細(xì)胞和PanIN-1b病變中陰性表達(dá)，而在胰腺導(dǎo)管腺癌、PanIN-2和PanIN-3中miRNA呈陽(yáng)性表達(dá)，提示miRNA-196a與胰腺癌的胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。Dillhoff等［17］在一項(xiàng)80例胰腺癌患者研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA-21強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)僅出現(xiàn)在胰腺癌標(biāo)本中，如果在非腫瘤組織中檢測(cè)到miRNA-21，那么僅呈弱陽(yáng)性表達(dá)。并且發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-21的預(yù)后(中位生存期15．2個(gè)月)顯著低于miR-21低表達(dá)患者(中位生存期27．7個(gè)月) (P=0．037)。Ma等［18］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-27a在胰腺癌組織中呈過(guò)表達(dá)，下調(diào)miRNA-27a表達(dá)后胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度、復(fù)制速度以及侵襲能力均下降，而且對(duì)細(xì)胞侵襲能力起抑制作用的 Sprouty2蛋白表達(dá)上調(diào)。Greither等［19］發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中miR-155、miR-203、miR-210、miR-222等高表達(dá)的患者預(yù)后較差。Nakata等［20］發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織miR-10b上調(diào)，miR-10b能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展和侵襲，miR-10b表達(dá)水平與胰腺癌患者預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)，即miR-10b高表達(dá)提示著預(yù)后不良。

在胰腺癌中表達(dá)下調(diào)或缺失的microRNA可能在胰腺癌的形成和發(fā)展中起到抑癌基因的作用。2007年Bloomston等［21］研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中miRNA-375表達(dá)降低，在胰腺癌進(jìn)展中起到類似抑癌基因的作用。后期發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者中6種miRNA(miR-452、miR-105等)表達(dá)水平升高者其生存時(shí)間較普通患者更長(zhǎng)(超過(guò)2年)。在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)miR-96水平的升高可使胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低，同時(shí)伴隨K-ras表達(dá)水平降低［22］。

3 m iR-216a在胰腺癌中的表達(dá)

miR-216a定位于基因組2p16．1。研究表明miR-216a在胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)。Kong等［23］在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miR-216a可當(dāng)作急性胰腺炎發(fā)作時(shí)胰腺損害的潛在標(biāo)志物。Szafranska等［24］發(fā)現(xiàn)miRNA-216是胰腺組織所特異的，但miRNA-216在胰腺癌組織及癌細(xì)胞株中并不表達(dá)或僅微量表達(dá)。因此，miRNA-216a可能是有潛力的生物標(biāo)記物。我們的前期研究比較胰腺癌和正常胰腺組織中microRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)70個(gè)microRNA的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中與正常組織相比，hsa-miR-216a等在胰腺癌患者中表達(dá)顯著下調(diào)。

4 m iR-216a在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起到的作用

miRNA通過(guò)與靶mRNA的3＇UTR堿基配對(duì)，從而抑制mRNA的翻譯或直接使mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致基因沉默。YB-1(Y box-binding-1)蛋白是一種核酸結(jié)合蛋白，它通過(guò)結(jié)合許多基因的啟動(dòng)子上的Y-box序列來(lái)促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，在乳腺癌的研究中科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)YB-1為miR-216a的一個(gè)靶基因，miR-216a能下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子 YB-1的表達(dá)［25-26］。Jeyapalan等［27］通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-216a可使其靶蛋白CD44的表達(dá)降低，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞活化達(dá)到限制腫瘤血管新生的目的。張雪梅等［28］研究發(fā)現(xiàn)miR-216a可抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和侵襲能力，并證實(shí)了PKCα(蛋白激酶Cα)是miR-216a調(diào)控的直接靶基因，通過(guò)siRNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)了下調(diào)PKCα表達(dá)確實(shí)能抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。趙文健等［29］等研究證實(shí)了PKCα是miR-216a調(diào)控的直接靶基因，并且也通過(guò)siRNA干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)了下調(diào)PKCα表達(dá)確實(shí)能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，它能部分模擬miR-216a的抑瘤功能，說(shuō)明miR-216a可通過(guò)靶向調(diào)控PKCα表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲，這進(jìn)一步揭示了miR-216a的抑瘤分子機(jī)制。我們前期通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)miR-216a在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯低于胰腺良性病變組織，提示miR-216a表達(dá)下調(diào)參與了胰腺癌的發(fā)生，miR-216a在胰腺癌發(fā)生中可能起抑癌基因的作用，進(jìn)一步研究篩選并驗(yàn)證JAK2是miR-216a的靶基因，在體內(nèi)外細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平驗(yàn)證了miR-216a能通過(guò)抑制靶基因JAK2表達(dá)水平，而抑制腫瘤生長(zhǎng)。說(shuō)明miR-216a可通過(guò)靶向調(diào)控 JAK2表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。

5 m iR-216a在胰腺癌中的表達(dá)意義

miR-216a可能成為胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物。Sun等［30］發(fā)現(xiàn)miR-216是胰腺高特異性miRNA之一。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示miR-216a在胰腺炎大鼠血清也特異性高表達(dá)［31］。miR-216a在胰腺癌中的表達(dá)下調(diào)，讓我們可以認(rèn)為通過(guò)對(duì)患者血液、糞便、尿液、胰液、胰腺穿刺組織等檢測(cè)miR-216a含量，來(lái)提高胰腺癌的早期診斷率和明確鑒別診斷，但是miR-216a在胰腺癌患者組織等的表達(dá)檢測(cè)仍受檢測(cè)技術(shù)等方面的限制，使miR-216a成為胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物并且廣泛用于臨床診療方面需進(jìn)一步研究和發(fā)展。

miR-216a有望作為胰腺癌靶向治療點(diǎn)。Chen等［32］報(bào)道建立K-ras(val12)突變基因的siRNA腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性表型;有研究證實(shí)［33］利用RNAi抑制凋亡相關(guān)基因Survivn表達(dá)，可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株凋亡，并能提高其輻射敏感性。我們利用模擬激動(dòng)劑(hibitor和agomir-216a)通過(guò)細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明抑制靶基因JAK2表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，抑制胰腺癌裸鼠模型瘤體的生長(zhǎng)。所以可以對(duì)miR-216a進(jìn)行基因沉默、反義寡核苷酸阻斷或miRNA修飾，可能為胰腺癌提供新的治療途徑。雖然目前臨床應(yīng)用并不十分滿意，但動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果令人振奮，可以肯定的是，miRNA 216a在胰腺癌診斷標(biāo)志物和治療手段具有重要的潛在價(jià)值。

6 展望

隨著miRNA研究的興起和深入研究，以及在檢測(cè)特異性miRNA各種不同研究方法和新技術(shù)、新科技的應(yīng)用，為人類腫瘤治療提供了新的方向和嶄新手段。miRNA與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、治療密切相關(guān)，但其在胰腺癌中的作用機(jī)制還未完全明確，在臨床應(yīng)用方面還未深入進(jìn)行，miR-216a作為胰腺癌的一個(gè)起到抑癌作用的潛在基因，檢測(cè)其在胰腺癌中低表達(dá)，并證實(shí)其通過(guò)抑制相關(guān)靶基因促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，提示其在精確調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因上可能有重要作用。MicroRNA檢測(cè)對(duì)胰腺癌的早期診斷和細(xì)胞靶向治療都有很大的臨床價(jià)值，相信隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在胰腺癌的早期有效診治方面MicroRNA將發(fā)揮極其重要的用途?？傊?，miRNA將成為胰腺癌診斷、疾病預(yù)防、生物治療的創(chuàng)新點(diǎn)、突破口、新方案，有著無(wú)限的應(yīng)用前景和不可低估的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

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