周恒偉，鄒丹，白大峰，金戈，唐迪瑩，張祖源，王蒙，李欣欣，張怡光

（1.沈陽市蘇家屯區(qū)中心醫(yī)院門診藥房，沈陽110101；2.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院藥理學教研室，沈陽110034）

水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42致癡呆模型小鼠學習記憶障礙的改善作用

周恒偉1，鄒丹2，白大峰1，金戈2，唐迪瑩2，張祖源2，王蒙2，李欣欣2，張怡光2

（1.沈陽市蘇家屯區(qū)中心醫(yī)院門診藥房，沈陽110101；2.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院藥理學教研室，沈陽110034）

目的探討水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42小鼠學習記憶障礙的改善作用。方法健康費城癌癥研究所（ICR）小鼠（60只）隨機均分為4組：假手術組、模型組、多奈哌齊組、水飛薊賓低劑量（100 mg·kg-1·d-1）組和水飛薊賓高劑量（200 mg·kg-1·d-1）組。連續(xù)給藥8 d，行為學評價學習記憶的改善作用。結果與模型組比較，水飛薊賓高劑量組自發(fā)反應交替率，1 h、24 h優(yōu)先指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。ELISA檢測結果顯示：與模型組比較，水飛薊賓高劑量組IL-6表達顯著降低，水飛薊賓高劑量組IL-4表達顯著減少（P＜0.01）。結論水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42小鼠學習記憶障礙有明顯的改善作用。其機制可能通過降低腦組織中的炎癥相關因子水平有關。

水飛薊賓；學習記憶障礙；炎性因子

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種常見的與年齡相關的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退、嚴重認知功能障礙和人格異常［1］。此病起病隱匿，病程進行緩慢，是老年癡呆中最常見的一種類型。AD患者腦內的主要病理改變包括細胞外以β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積為中心形成的老年斑（senile plaques，SP）、過度磷酸化tau蛋白造成的細胞內神經(jīng)原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）、選擇性神經(jīng)元丟失及神經(jīng)營養(yǎng)不良、突觸丟失等。此外，AD的產(chǎn)生和發(fā)展還與炎性反應、線粒體結構功能異常等密切相關［2］。研究報道，水飛薊賓能夠對抗Aβ引起的短期空間記憶、長期識別記憶以及關聯(lián)記憶的損傷，但是并不影響小鼠的運動能力、探索行為和痛閾。此外，水飛薊賓顯著抑制Aβ誘導的海馬區(qū)丙二醛（malondialdehyde，MDA）的產(chǎn)生，同時升高谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平［3］。為了進一步探索水飛薊賓在AD治療中的作用，本研究探討水飛薊賓對Aβ1-42致癡呆模型小鼠學習記憶障礙的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠側腦室注射凝聚態(tài)Aβ1-42致癡呆模型的制作：清潔級健康費城癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠60只，雄性，體質量24～30 g，由沈陽藥科大學實驗動物中心提供。小鼠水合氯醛麻醉后，微量進樣器側腦室一次性注入4 μL凝聚態(tài)Aβ1-42（含Aβ1-42 410 pmol）。留針2 min，假手術組小鼠側腦室給予等體積生理鹽水。Aβ1-42預處理：無菌生理鹽水溶解后，37℃120 h使其成凝聚態(tài)。

1.1.2 實驗動物分組及給藥：造模后實驗動物隨機分為假手術組、模型組、多奈哌齊組、水飛薊賓低劑量組和水飛薊賓高劑量組。實驗小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后給藥。假手術組及模型組按體質量給予生理鹽水，多奈哌齊組給予多奈哌齊（1.3 mg·kg-1·d-1），水飛薊賓組給予不同劑量水飛薊賓（低劑量為100 mg·kg-1·d-1；高劑量為200 mg·kg-1·d-1）；恒溫恒濕環(huán)境下飼養(yǎng)［（24±1）℃，（40±4）%］，12 h循環(huán)燈光（08：00-20：00），自由攝食及飲水。給藥期間每天稱重，觀察動物狀態(tài)并記錄。連續(xù)給藥8 d后進行相關實驗。

1.1.3 藥品、試劑及儀器

水飛薊賓（河南協(xié)力藥業(yè)公司，批號：20130804）、A β 1-42（Sigama公司，批號：1001602474）、小鼠白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）ELISA試劑盒（貨號：MU30384，上海邦亦生物公司）、小鼠白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（貨號：MU30044，上海邦亦生物公司）。酶標定量測試儀（奧地利特TECAN公司）、-80℃低溫冰箱（中科美菱）；J2-SH低溫超速離心機（美國BECKMAN公司）；機械勻漿機（上海凈信科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Y迷宮：實驗裝置由3個成120°夾角的等長木制支臂組成，即迷宮的A、B、C 3臂。每臂長40 cm，高12 cm，上寬10 cm，下寬4 cm。實驗時將小鼠放入3個臂交接處，讓其自由出入3個臂，記錄4 min內每只小鼠進入3個臂的順序及總次數(shù)，以連續(xù)進入3個不同的臂為1次正確交替反應，記錄正確交替反應次數(shù)。用自發(fā)交替反應率反映空間工作記憶能力。自發(fā)反應交替率（%）=正確進臂次數(shù)/（進臂總次數(shù)-2）×100［4］。

1.2.2 小鼠新物體辨別：本實驗分為適應環(huán)境階段和測試階段。適應環(huán)境階段：每只小鼠放入測試箱自由探索10 min，連續(xù)2 d。測試階段，同樣小鼠適應環(huán)境3 min，然后將小鼠取出。將2個完全相同的測試物體（A1、A2）置于測試箱距箱壁8 cm處呈直線排開。每組小鼠面向盒壁放入盒中，記錄4 min內探索兩物體的時間（tA1、tA2）。1 h后，將其中原來測試物體物體中1個換成1個新物體（B），將小鼠再次放入，記錄探索兩物體所用時間（tA1、tB）。24 h后，將物體B換成1個新物體（C），將小鼠再次放入，記錄探索兩物體所用時間（tA1、tC）。優(yōu)先指數(shù)計算公式：Preferential inde（x1 h/24 h）=tB（/tA1+tB）［4］。

1.2.3 酶聯(lián)免疫法測定海馬組織IL-6、IL-4含量：各組小鼠于給藥后第8天處死，皮層海馬組織樣本放于-80°C冰箱備用。每只鼠取10 mg海馬組織加入140 μL PBS溶液中，超聲勻漿后3 000g離心14 min后，取上清液。按照ELISA試劑盒說明書操作，每孔加樣品40 μL，經(jīng)37℃溫育30 min，洗滌4次，37℃避光顯色14 min，終止反應后440 nm波長依序測量各孔的吸光度（optical density，OD）。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 自發(fā)交替反應實驗結果

實驗結果表明：假手術組、模型組、多奈哌齊組、水飛薊賓低劑量組和水飛薊賓高劑量組小鼠進入Y迷宮3個臂的總次數(shù)分別為23.818±3.646、26.012±6.884、24.364±7.684、22.182±4.240、24.444± 7.034，組間未見統(tǒng)計學差異（P＞0.04）。提示水飛薊賓未對小鼠自發(fā)活動產(chǎn)生明顯影響。與假手術組比較，模型組小鼠Y迷宮自發(fā)交替反應率顯著下降（P＜0.001）；與模型組比較，水飛薊賓劑量依賴性增加小鼠Y迷宮自發(fā)交替反應率（P＜0.01）。見表1。

2.2 新物體辨別實驗結果

結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠1 h及24 h測試階段的優(yōu)先指數(shù)和辨別系數(shù)顯著降低（P＜0.001）。與模型組比較，水飛薊賓劑量依賴性升高模型鼠1 h及24 h測試階段的優(yōu)先指數(shù)（P＜0.01），見表2、3。

2.3 各組小鼠海馬組織IL-4、IL-6含量結果

表1 水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42各組小鼠自發(fā)交替反應率及進臂總次數(shù)影響（%）Tab.1 Effects of silibinin on the impairment of spontaneous alteration behavior induced by ICV Aβ1-42 in the Y-maze test（%）

表2 水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42小鼠新物體辨別1 h及24 h優(yōu)先指數(shù)的影響（%）Tab.2 Effects of silibinin on preferential index for new object of 1 h and 24 h in the novel object recognition test in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42（%）

表3 水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42小鼠新物體辨別1h及24 h辨別系數(shù)的影響（%）Tab.3 Effects of silibinin on discrimination index for new object of 1h and 24h in the novel object recognition test in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42（%）

實驗結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠抗炎因子IL-4顯著降低而促炎性因子IL-6升高（P＜0.01），與模型相比較，水飛薊賓顯著增加抗炎因子IL-4表達（P＜0.04），降低IL-6表達（P＜0.01）。見表4。

3 討論

神經(jīng)病理學研究揭示了炎癥與AD密切相關。AD患者尸檢顯示，腦組織內促炎性因子增加，尤其是在斑塊附近增加的更加明顯［6］。IL-6是一種多向性的細胞因子，與其水溶性受體或膜受體結合后形成有活性的IL-6受體復合物，介導免疫應答和炎性反應，調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞生長和分化。自1991年Bauer等［7］在AD患者腦中發(fā)現(xiàn)IL-6以來，已經(jīng)有大量的研究結果表明，IL-6在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。IL-4是抗炎性細胞因子，誘導成熟T2型輔助細胞（Th2細胞）、肥大細胞或嗜堿性粒細胞，能夠趨化Th2應答之一；介導肥大細胞的募集和活化，刺激IgE抗體產(chǎn)生［8］。研究表明IL-4參與AD的發(fā)病機制［9］。AD患者基底核及外周單核細胞的IL-4較正常對照組均減少［10］。流行病學及臨床觀察發(fā)現(xiàn)抗炎藥物可延遲AD發(fā)病，減緩AD進程并改善AD的認知障礙。因此抗炎機制成為防治AD的一個新的研究方向。

表4 水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42小鼠海馬IL-4，IL-6影響Tab.4 Effects of silibinin on IL-6 and IL-4 expression in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42

表4 水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42小鼠海馬IL-4，IL-6影響Tab.4 Effects of silibinin on IL-6 and IL-4 expression in mice with i.c.v.injection of Aβ1-42

1）P＜0.01 compared with sham group；2）P＜0.04；3）P＜0.01 compared with model group.

水飛薊賓為黃酮類化合物，文獻報道具有抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護作用［11］。本次實驗我們考察水飛薊賓是否可以通過減少炎性因子表達而產(chǎn)生改善學習障礙的作用，行為學Y迷宮檢測得出水飛薊賓對側腦室注射Aβ1-42模型鼠空間記憶的改善作用；新物體辨別實驗主要考察藥物對側腦室注射Aβ 1-42模型鼠視覺辨別能力的改善作用，結果顯示水飛薊賓高劑量組對AD模型小鼠學習記憶障礙改善作用顯著。與文獻報道的研究結果一致［3］。實驗中，我們對小鼠側腦室注射Aβ后8 d海馬內促炎性因子IL-6含量及抗炎性因子IL-4含量進行了測定。結果表明水飛薊賓在改善模型小鼠學習記憶障礙的同時，可劑量依賴性地抑制癡呆小鼠海馬IL-6表達的增加及IL-4表達的減少。提示水飛薊賓改善認知及記憶障礙作用與中樞抗炎作用相關。前期的研究結果顯示水飛薊的抗氧化作用明顯，能夠改善藥源性腎損傷［12］，是否可以通過抗氧化作用和神經(jīng)保護作用改善學習記憶障礙還有待進一步探討。

［1］Reddy.PH Abnormal tau，mitochondrial dysfunction，impaired axonal transport of mitochondria，and synaptic deprivation in Alzheimer′s disease［J］.Brain Res，2011，1414（30）：136-148.

［2］Reddy PH，Beal MF.Amyloid beta，mitochondrial dysfunction and synaptic damage：implications for cognitive decline in aging and Alzheimer′s disease［J］.Trends Mol Med，2008，14（2）：44-43.

［3］Lu P，Mamiya T，Lu L，et al.Silibinin attenuates amyloid{beta}24-34 peptide-induced memory impairments：implication of inducible nitric oxide synthase（iNOS）and tumor necrosis factor-alpha（TNF-{alpha}）in mice［J］.J Pharmacol Exp Ther，2009，331（7）：319-326.

［4］Nagakura A，Shitaka Y，Yarimizu J，et al.Characterization of cognitive deficits in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease and effects of donepezil and memantine［J］.Euro J Pharmacol， 2013，703（1-3）：43-61.

［5］Win-Shwe TT，F(xiàn)ujimaki H，F(xiàn)ujitani Y，et al.Novel object recognition ability in female mice following exposure to nanoparticle-rich diesel exhaust［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，262（3）：344-362.

［6］Griffin WST，Sheng JG，Roberts GW，et al.Interleukin-1 expression in different plaque types in Alzheimer’s disease：significance in plaque evolution［J］.J Neuropathol Exp Neurol，1994，44（2）：276-281.

［7］Bauer J，Strauss S，Schreiter-Gasser U，et al.Interleukin-6 and α-2macroglobulin indicate an acute-phase state in Alzheimers disease cortices［J］.FEBS Lett，1991，284（1）：111-114.

［8］Luzina IG，Keegan AD，Heller NM，et al.Regulation of inflammation by interleukin-4：a review of alternatives［J］.J Leukocyte Biol，2012，92（4）：743-764.

［9］Gadani SP，Cronk JC，Norris GT，et al.IL-4 in the brain：a cytokine toremember［J］.J Immunol，2012，189（9）：4213-4219.

［10］Reale M，Iarlori C，F(xiàn)eliciani C，et al.Peripheral chemokine receptors，their ligands，cytokines and Alzheimer’s disease［J］.J Alzheimer’s Dis，2008 14（2）：147-149.

［11］Tota S，Kamat PK，Shukla R，et al.Improvement of brain energymetabolism and cholinergic functions contributes to the beneficial effects of silibinin against streptozotocin induced memory impairment［J］.Behav Brain Res，2011，221（1）：207-214.

［12］金戈，王俊平，孫慧哲，等.水飛薊賓聯(lián)合維生素E對慶大霉素引起的藥源性腎損傷的作用［J］.中國醫(yī)科大學學報，2013，42（6）：404-407.

（編輯 武玉欣）

Silibinin ImprovementofLearning and Memory Disordersin a Dementia Mouse ModelInduced by Intracerebroventricular Injection ofAβ1-42

ZHOU Heng-wei1，ZOU Dan2，BAI Da-feng1，JIN Ge2，TANG Di-ying2，ZHANG Zhu-yuan2，WANG Meng2，LI Xin-xin2，ZHANGYi-guang2
（1.Bureau of Outpatient Medicine，Sujiatun District Central Hospital，Shenyang 110101，China；2.Deparment of Pharmacology，School of Basic Medicine，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo observe the effectsofsilibinin on the improvementoflearning and memory impairmentin a mouse modelinjected with Aβ 1-42.MethodsA total of 60 healthy ICR mice were randomly divided into sham group，model group，the donepezil group，silibinin low-dose group，silibinin high-dose group.After8 days administration，behavioraltests were performed to evaluate the learning and memory improvement.Re?sultsCompared with the modelgroup，spontaneous alternation behavior，1 hourand 24 hourpreferentialindex silibinin high dose group were significantly improved in silibinin high-dose group.ELISA testshowed that：compared with the modelgroup，silibinin treatmentsignificantly reduced IL-6 and IL-4 expression（P＜0.01）.ConclusionSilibinin significantly improved learning and memory disorders in the mouse dementia model induced by intracerebroventricularinjection ofAβ1-42.The reduction ofinflammation factorlevels in the brain tissue could be one ofthe mechanisms.

silibinin；learning and memory impairment；inflammatory cytokines

R964

A

0248-4646（2014）04-0341-03

沈陽市科學技術計劃（F13-220-9-27）；遼寧省教育廳高?？蒲杏媱潱↙2010447）

周恒偉（1976-），男，主管藥師，本科.

金戈，E-mail：jinge1026@163.com

2014-02-19

網(wǎng)絡出版時間：