香蕉枯萎病菌全局性調(diào)控因子FocVeA基因的克隆及功能預(yù)測(cè)

漆艷香 張欣 陸英 張賀 蒲金基 喻群芳 謝藝賢

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海口 571101）

香蕉枯萎病菌全局性調(diào)控因子FocVeA基因的克隆及功能預(yù)測(cè)

漆艷香 張欣 陸英 張賀 蒲金基 喻群芳 謝藝賢

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶農(nóng)林有害生物入侵監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，?？?571101）

根據(jù)輪枝樣鐮刀菌（Fusarium verticillioides）和藤倉(cāng)鐮刀菌（F. fujikuroi）veA同源基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR與RT-PCR技術(shù)分別克隆了香蕉枯萎病菌2個(gè)生理小種的FocVeA基因序列和開(kāi)放閱讀框，同時(shí)對(duì)該基因的編碼蛋白進(jìn)行序列特征、系統(tǒng)發(fā)育與結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明，2個(gè)生理小種的FocVeA基因（分別命名為F1VeA和F4VeA）的DNA片段全長(zhǎng)分別為1 693 bp 和1 690 bp，開(kāi)放閱讀框分別為1 599 bp 和1 596 bp，分別編碼532個(gè)和531個(gè)氨基酸。F1VeA和F4VeA基因預(yù)測(cè)氨基酸序列相似性均為99%，與GenBank中公布的Fusarium spp. veA基因氨基酸序列均有78%-99%相似性。系統(tǒng)聚類分析顯示，F(xiàn)1VeA和F4VeA與GenBank中已登錄的輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）和藤倉(cāng)鐮刀菌（F. fujikuroi）等veA同源蛋白高度同源。蛋白質(zhì)保守域搜索表明，F(xiàn)ocVeA具有veA蛋白的功能域，屬于veA蛋白家族的一員，推測(cè)該基因可能參與調(diào)控F. oxysporum f. sp. cubense的生長(zhǎng)、毒素合成及致病性等。

香蕉枯萎病菌 FocVeA基因 克隆 序列分析

絲狀真菌次級(jí)代謝是一個(gè)復(fù)雜的多層次調(diào)控過(guò)程，次級(jí)代謝物的生物合成不僅受到途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)途徑調(diào)控性因子的調(diào)控，而且受到全局性調(diào)控因子的調(diào)控［1］。研究表明，veA基因在多

種致病真菌中調(diào)控次級(jí)代謝基因簇的表達(dá)及致病性相關(guān)毒素的生物合成，并影響病原菌的形態(tài)分化和致病性，且具有廣泛存在性及其功能的保守性，是一個(gè)重要的全局性調(diào)控因子［2-11］。迄今為止veA基因已經(jīng)在許多絲狀真菌中相繼被報(bào)道，其功能和作用機(jī)制也成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，F(xiàn)oc）引起的香蕉枯萎病是一種毀滅性土傳病害，嚴(yán)重影響香蕉的產(chǎn)量和品質(zhì)，已給中國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，次生代謝物毒素在尖孢鐮刀菌致病過(guò)程中起著重要作用，是重要的致病因子［12］。盡管鐮刀菌毒素在香蕉枯萎病菌致病過(guò)程中的作用已被廣泛關(guān)注，迄今尚未見(jiàn)到有香蕉枯萎病菌致病毒素生物合成途徑中相關(guān)調(diào)控因子的分離報(bào)道。

本研究采用同源序列法從F. oxysporum f. sp. cubense中分離veA同源基因FocVeA并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)FocVeA基因的蛋白結(jié)構(gòu)及其功能，旨在為進(jìn)一步研究該因子在香蕉枯萎病菌致病過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉枯萎病菌1號(hào)生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 1，F(xiàn)oc1）和香蕉枯萎病菌4號(hào)生理小種（F. oxysporum f. sp. cubense race 4，F(xiàn)oc4），由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹(shù)病害課題組鑒定，保存。

1.2 方法

1.2.1 香蕉枯萎病菌基因組DNA和總RNA的制備 將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d，用載玻片刮取培養(yǎng)基表面的菌絲。分別按照BioMiga Fungal gDNA Kits和E.Z.N.A. Fungal RNA Kits說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA和總RNA。按照 M-MLV說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.2.2 香蕉枯萎病菌FocVeA基因的PCR擴(kuò)增與克隆 根據(jù)同源物種輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）的FvVE1基因（DQ274059）和藤倉(cāng)鐮刀菌（F. fujikuroi）的FfVel1基因（FN548142）設(shè)計(jì)1對(duì)引物：AF1（5'-ATGGCTACACCATCCTCGATTCC-3'）/AR-1674（5'-CCGCCCTACTCGTCATAATACC-3'）。分別以Foc1和Foc4基因組DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系均為25 μL：10×PCR Buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol）2 μL，正向和反向引物各（20 μmol/L）各0.5 μL，高保真Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，模板DNA（20 ng/μL）1 μL，補(bǔ)滅菌雙蒸水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 3 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收、連接分別按照BioMiga和TaKaRa相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，陽(yáng)性克隆送上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI的BLAST搜索數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列同源性和保守結(jié)構(gòu)域分析，用 EBI提供的在線軟件ClustalW2對(duì)目的基因所編碼氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，使用Mega 4.1 軟件的鄰接法構(gòu)建NJ 系統(tǒng)樹(shù)。利用Softberry（http：//www. softberry.com/）、ExPASy（http：//www.expasy.org/）、WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_ psort.html/）、Euk-mPLoc 2.0、GOR4、SWISS-MODEL Repository（http：//swissmodel.expasy.org/repository/）等網(wǎng)上綜合軟件包，對(duì)目的基因分別進(jìn)行編碼蛋白的理化性質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)分析和功能結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與序列分析

分別以Foc1和Foc4基因組DNA為模板，用引物AF1和AR1674進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得長(zhǎng)約1 700 bp的條帶（圖1）。以cDNA為模板用AF1和AR1674引物進(jìn)行PCR，分別獲得長(zhǎng)約1 600 bp的條帶（圖2）。

圖1 FocVeA基因DNA PCR擴(kuò)增

圖2 FocVeA基因cDNA RT-PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增條帶的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定后進(jìn)行多個(gè)個(gè)體測(cè)序，序列保持一致。核苷酸序列分析表明，以基因組DNA為模板時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1 693 bp和1 690 bp，以cDNA為模板時(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1 599 bp和1 596 bp。將DNA序列與cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)小種的FocVeA基因均含有包含1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，內(nèi)含子長(zhǎng)度均為94 bp，這與F. verticillioides的FvVE1和F. fujikuroi的FfVel1基因結(jié)構(gòu)一致。2個(gè)小種的FocVeA基因DNA序列已提交GenBank（登錄號(hào)分別為：KF745043和KF745042），并分別命名為F1VeA和F4VeA。

2.2 FocVeA預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)分析

利用ExPASy網(wǎng)站的Protparam程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行組分分析，結(jié)果顯示F1VeA和F4VeA基因分別編碼532和531個(gè)氨基酸，只有一個(gè)氨基酸的差異，相對(duì)分子質(zhì)量分別為59.28 kD 和59.17 kD；理論等電點(diǎn)分均為9.06。其中正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)均為66，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)均為59，非極性氨基酸殘基（AILMFPWV）總數(shù)分別為204和203，極性氨基酸殘基（NCQGHSTY）總數(shù)均為203，不穩(wěn)定系數(shù)分別為74.79和75.28，半衰期均為30 h，說(shuō)明FocVeA蛋白為不穩(wěn)定的微堿性蛋白。應(yīng)用Hphob./Kyte & Doolittle算法，預(yù)測(cè)2個(gè)小種的FocVeA蛋白疏水性平均值分別為-0.929和-0.928，脂溶指數(shù)分別為54.1和54.2，說(shuō)明FocVeA屬于脂溶性、親水性蛋白。

2.3 FocVeA預(yù)測(cè)蛋白同源性分析

經(jīng)Blast同源性分析，F(xiàn)1VeA和F4VeA基因序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列相似性均為99%，與輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）的FvVE1（ABC02879.1）、藤倉(cāng)鐮刀菌（F. fujikuroi）的FfVel1（CBE54373.1）和禾谷鐮刀菌（F. graminearum）的FgVe1（ADQ27445.1）等veA蛋白高度同源，相似性高達(dá)78%-99%，而與其它屬的veA蛋白同源性較低，只有41%-63%的相似性。系統(tǒng)聚類結(jié)果（圖3）表明，香蕉枯萎病菌2個(gè)生理小種的FocVeA優(yōu)先與3種鐮刀菌聚為一類，置信度為100%，親緣關(guān)系最近，由此推測(cè)FocVeA蛋白屬于veA蛋白家族成員。

圖3 香蕉枯萎病菌FocVeA蛋白與其它絲狀真菌veA蛋白序列進(jìn)化樹(shù)

2.4 FocVeA預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 保守結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI的Blast軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行FocVeA推導(dǎo)性蛋白結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果（圖4）表明，該蛋白保守區(qū)序列集中于蛋白質(zhì)的N端，且N-末端都包含一個(gè)推測(cè)的絲絨蛋白超級(jí)家族區(qū)域

（VSFD）和一個(gè)雙組分核定位信號(hào)NLS區(qū)域；同時(shí)該蛋白的C-末端有一個(gè)富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）和蘇氨酸（T）的潛在PEST結(jié)構(gòu)域（PM），由此推測(cè)FocVeA屬于veA蛋白家族。

圖4 幾種鐮刀菌屬真菌veA蛋白保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的比較

2.4.2 跨膜區(qū)與信號(hào)肽分析 用Tmpred Server對(duì)FocVeA氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，F(xiàn)1VeA與F4VeA均無(wú)跨膜區(qū)。經(jīng)SingaIP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，該氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽位點(diǎn)，不屬于分泌蛋白。此外，WoLFPSORT和Euk-mPLoc兩種不同的網(wǎng)絡(luò)工具進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，F(xiàn)ocVeA中存在一個(gè)雙組分核定位信號(hào)NLS區(qū)域，顯示該基因定位于細(xì)胞核中。

2.4.3 功能結(jié)構(gòu)域分析 利用GOR4在線分析顯示，F(xiàn)1VeA 與 F4VeA分別含12.41%和12.43%的α-螺旋，12.22 %和12.24%的延伸鏈，75.38%和75.33%的無(wú)規(guī)則卷曲，二者均無(wú)β折疊和β轉(zhuǎn)角，表明FocVeA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲。此外，通過(guò)NetPhos 2.0的有磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)1VeA與F4VeA蛋白的絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)分別為37個(gè)與38個(gè)，酪氨酸（Tyr）磷酸化位點(diǎn)分別為10個(gè)與9個(gè)，而蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)均為12個(gè)，這些位點(diǎn)的存在說(shuō)明蛋白翻譯后修飾對(duì)FocVeA蛋白功能的完成或改變起到重要作用。

3 討論

尖孢鐮刀菌產(chǎn)生的毒素是一種具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在尖孢鐮刀菌致病過(guò)程中起重要作用，是重要的致病因子。香蕉枯萎病菌在致病過(guò)程中產(chǎn)生的毒素（如鐮刀菌酸，F(xiàn)A）在病菌侵入寄主后，可導(dǎo)致維管束細(xì)胞產(chǎn)生褐變、壞死等病理變化［13］。目前對(duì)香蕉枯萎病菌毒素的相關(guān)研究和報(bào)道集中在粗毒素成分［14，15］、鈍化物篩選［16，17］、抗病突變體篩選［18］、與毒素泵出相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白foABC1基因的克隆及序列分析［19］等研究，但迄今為止，有關(guān)香蕉枯萎病菌致病毒素生物合成途徑中相關(guān)調(diào)控因子的分離仍未見(jiàn)報(bào)道。

全局性調(diào)控因子veA是在絲狀真菌中普遍存在的調(diào)控因子之一，對(duì)絲狀真菌生長(zhǎng)發(fā)育、毒素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成以及致病性等重要的生命過(guò)程起調(diào)控作用［20］。目前veA同源基因已相繼在一些絲狀

真菌中被克隆分析，但在不同的真菌中，即使是曲霉的不同種中，veA蛋白的功能也有很大差異。如構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）veA、黃曲霉（A. flavus）veA、寄生曲霉（A. parasiticus）veA、輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）FvVE1、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）FgVEA、藤倉(cāng)鐮刀菌（F. fujikuroi）FfVel1、小麥殼針孢病菌（M. graminicola）MVE1、頂頭孢霉（ Acremonium chrysogenum）AcVEA均為veA同源基因，但突變后的表型卻有差異。

研究發(fā)現(xiàn)，veA基因參與絲狀真菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢過(guò)程。在曲霉中，A. nidulans 的veA敲除突變體（△veA）表現(xiàn)異常，且在有利于有性繁殖的條件下培養(yǎng)也不產(chǎn)閉囊殼，卻產(chǎn)生大量分生孢子［2］。A. flavus的△veA也具有相似的表型，表現(xiàn)為分生孢子產(chǎn)量增加，菌核產(chǎn)量減少［3］。而A. parasiticus的△veA除分生孢子和菌核產(chǎn)量均減少外，還完全喪失了產(chǎn)橫隔能力［4］。在鐮刀菌中，△FvVE1除氣生菌絲生長(zhǎng)和菌落表面疏水性受抑制和菌絲極性改變外，還出現(xiàn)大型分生孢子與小分生孢子的比例增大現(xiàn)象［5，6］。在赤霉病菌中也有類似的現(xiàn)象，△FgVEA氣生菌絲減少，疏水性降低，但其產(chǎn)孢量增加，孢子萌發(fā)延遲［7，8］。而△FfVel1氣生菌絲和分生孢子數(shù)則減少，子囊殼數(shù)量則增多［9］?！鱉VE1與FvVEl類似，具體表現(xiàn)為氣生菌絲減少，不受光照影響，液體培養(yǎng)下菌絲膨脹、極性改變［10］。與野生型相比，△AcVEA分生孢子形成提前，菌絲頂端呈高度分枝狀［11］。由此說(shuō)明veA在不同菌體中調(diào)控形態(tài)發(fā)育的機(jī)制可能有所差異。

研究還發(fā)現(xiàn)，veA基因參與調(diào)控絲狀真菌毒素及色素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。在曲霉中，A. nidulans的△veA除完全喪失產(chǎn)柄曲霉毒素（ST）能力外，青霉素產(chǎn)量較野生型菌株也大大降低［21］。A. flavus的△veA幾乎抑制了黃曲霉毒素生物合成過(guò)程所有的調(diào)控基因的表達(dá)，從而完全喪失了產(chǎn)黃曲霉毒素的能力［3］。在鐮刀菌中也有相似現(xiàn)象，△FvVE1的煙曲霉毒素、串珠鐮刀菌毒素的合成下降、伏馬毒素合成中調(diào)控因子的表達(dá)也受抑制［5，6］；△FgVEA紅色色素合成呈顯著上升，但單端孢霉烯的合成顯著降低［7，8］?！鱂fVel1的色素比卡菌素合成上升，但伏馬毒素、赤霉素以及鐮刀菌素C合成受抑制［9］；△AcVEA的孢菌素C的產(chǎn)量明顯減少［11］。上述研究說(shuō)明veA基因在多個(gè)絲狀真菌中正調(diào)控次生代謝的合成。

另外，veA基因還影響絲狀真菌的致病性。A. flavus的△veA致病力顯著下降，因而不能在種子上正常定殖［22］?！鱂gVEA致病力喪失，以致菌體無(wú)法在麥穗上擴(kuò)展侵染［7，8］。同樣，接種△FfVel1后的水稻葉片也沒(méi)有表現(xiàn)出惡苗癥狀［9］；而在小麥殼針孢病菌中，△MVE1的致病性卻沒(méi)有改變［10］。這些研究結(jié)果說(shuō)明veA在不同絲狀真菌致病過(guò)程中的作用也各不相同。

Foc1和Foc4在侵染不同種的香蕉時(shí)存在較大的差異，F(xiàn)oc1只侵染粉蕉而Foc4幾乎能侵染所有香蕉品種。本研究獲得了香蕉枯萎病菌2個(gè)生理小種的FocVeA基因，且F1VeA和F4VeA的推測(cè)編碼蛋白僅1個(gè)氨基酸的差異，即F1VeA的潛在PEST結(jié)構(gòu)域比F4VeA多了一個(gè)脯氨酸（P）。PEST結(jié)構(gòu)域與蛋白快速折疊有關(guān)［9］，由此說(shuō)明FocVeA基因有可能是造成寄主差異和致病力差異的主要原因之一。其次，F(xiàn)1VeA和F4VeA的推測(cè)蛋白序列與veA同源基因FvVE1、FfVel1及FgVEA編碼蛋白高度相似，但該基因是否與香蕉枯萎病菌的生長(zhǎng)發(fā)育、毒素合成及致病性相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)同源序列法獲得了香蕉枯萎病菌全局性調(diào)控因子FocVeA基因序列和開(kāi)放閱讀框，結(jié)果表明，2個(gè)生理小種F1VeA和F4VeA的DNA片段全長(zhǎng)分別為1 693 bp 和1 690 bp，分別編碼532個(gè)和531個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)氨基酸序列相似性均為99%，系統(tǒng)聚類分析顯示，F(xiàn)1VeA和F4VeA與GenBank中已登錄的輪枝樣鐮刀菌（F. verticillioides）和藤倉(cāng)鐮刀菌（F. fujikuroi）等veA同源蛋白高度同源。蛋白質(zhì)保守域搜索表明，F(xiàn)ocVeA具有veA蛋白的功能域，屬于veA蛋白家族的一員，推測(cè)該基因可能參與調(diào)控F. oxysporum f. sp. cubense的生長(zhǎng)、毒素合成及致病性等。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Functional Prediction of the Global Regulator FocVeA Gene from Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Qi Yanxiang Zhang Xin Lu Ying Zhang He Pu Jinji Yu Qunfang Xie Yixian
（Key Laboratory of Monitoring and Control of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests，Ministry of Agriculture，Environment and Plant Protection Institute，CATAS，Haikou 571101）

Based on the conserved amino acid sequence of veA homologs from F. verticillioides and F. fujikuroi, FocVeA gene and its open reading frame of F. oxysporum f. sp. cubense race 1 and race 4（Foc1 and Foc4）were cloned by PCR and RT-PCR. Sequences characterization, phylogenetic clustering and conserved domains on the two predicted proteins of FocVeA gene were also analyzed, respectively. The results showed that the complete DNA sequences of FocVeA from Foc1 and Foc4（named as F1VeA and F4VeA）were 1 693 bp and 1 690 bp, respectively. The cDNA of F1VeA and F4VeA were 1 599 bp and 1 596 bp, and encoded a deduced protein of 532 amino acid and 531 amino acid, respectively. The deduced amino acid sequences of F1VeA and F4VeA shared 99% similar to each other, and had 78%-99% similarity with the sequences of veA factor from isolates of Fusarium spp., respectively. Phylogenetic clustering suggested that the amino acid sequences of F1VeA and F4VeA showed high similarity to veA homologs of F. verticillioides and F. fujikuroi deposited in GenBank. Conservative structure domain analysis showed that F1VeA and F4VeA had the sequence characteristics of veA gene family in filamentous fungi, which meant that FocVeA might involve in morphological development, toxin biosynthesis and pathogenicity of F. oxysporum f. sp. cubense.

Fusarium oxysporum f. sp. cubense FoVeA gene Cloning Sequence analysis

2014-03-20

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-32-04），中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2013hzs1J009）

漆艷香，女，博士，副研究員，研究方向：熱帶果樹(shù)病害的診斷、病原學(xué)及防治；E-mail：qiyanxiang@126.com

謝藝賢，男，研究員，研究方向：熱帶果樹(shù)病害及防治；E-mail：yixian81@126.com