金川多肋牦牛HOXC10基因的克隆、序列分析及組織表達(dá)

張亞南熊顯榮蘭道亮符梅張雁侯定超馬定美李善榮李鍵

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.金川縣畜牧獸醫(yī)局，金川 624100）

金川多肋牦牛HOXC10基因的克隆、序列分析及組織表達(dá)

張亞南1熊顯榮1蘭道亮1符梅1張雁1侯定超2馬定美2李善榮2李鍵1

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.金川縣畜牧獸醫(yī)局，金川 624100）

旨在克隆牦牛HOXC10基因，并進(jìn)一步分析該基因的結(jié)構(gòu)與功能以及揭示其組織特異性表達(dá)規(guī)律。以金川多肋牦牛為材料，根據(jù)GenBank已公布的綿羊HOXC10基因序列設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR技術(shù)對HOXC10基因的cDNA全長進(jìn)行擴(kuò)增，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及在各組織中的表達(dá)譜。對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，擴(kuò)增的牦牛HOXC10基因長度是1 272 bp，其中包含一個(gè)1 029 bp的開放閱讀框，共編碼342個(gè)氨基酸；同源性分析表明，牦牛與黃牛的相似性較高，為93.2%；預(yù)測HOXC10蛋白質(zhì)的分子量為38.2 kD，理論等電點(diǎn)為8.45；進(jìn)化樹分析顯示，牦牛與黃牛的親緣關(guān)系最近，處于同一個(gè)分支上；組織表達(dá)譜分析表明，該基因在牦牛各組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在肝臟中的表達(dá)量最高，胃中的表達(dá)量最低。

牦牛 克隆 HOXC10 序列分析 組織表達(dá)

HOX基因（Homeobox）也被稱為同源盒、同源框或同源異形基因，是一種調(diào)節(jié)動物胚胎發(fā)育的基因，并且在調(diào)控細(xì)胞的增殖分化方面也起著重要的作用，最早是由美國科學(xué)家Lewis利用果蠅雜交互補(bǔ)的方法發(fā)現(xiàn)的HOX基因幾乎存在于所有的兩側(cè)對稱的動物體內(nèi)，并且其調(diào)控機(jī)理很相似，HOX家族是指成簇存在的同源異形盒基因，基因間的同源性比率在70%-80%，該家族所編碼的蛋白質(zhì)均含

有由61個(gè)氨基酸組成的同源結(jié)構(gòu)域（homeodomeo，HD）［1］。目前，根據(jù)基因在染色體上的分布、序列的同源性及表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為兩類，一類HOX基因可以分為A、B、C和D 4個(gè)基因簇，串聯(lián)分布于7、17、1和2號染色體上；另一類HOX基因，又稱non-HOX基因，由多個(gè)散布于不同染色體的基因家族構(gòu)成，如TALE、CDX、PAX等［2］。HOXC10是HOX基因家族中重要的一員，目前已經(jīng)有研究表明，HOXC10不但影響脊椎動物的胚胎發(fā)育，更重要的是影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育［3］，同時(shí)也對脊椎動物的斷肢及尾部的再生過程有一定的影響［4］。

牦牛主要分布于我國青藏高原地區(qū)，約占世界牦牛總數(shù)的95%［5，6］，常生活在于海拔3 000 m以上，能充分利用高寒草地牧草資源，對高寒草地的生態(tài)環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┥a(chǎn)和生活必需品，是青藏高原地區(qū)牧民的重要生活和經(jīng)濟(jì)來源。在長期的自然選擇和人工選擇的共同作用下，牦牛對高海拔、低溫、低氧牧區(qū)具有良好適應(yīng)性，能利用高寒草場資源帶來優(yōu)質(zhì)、安全、營養(yǎng)的綠色食品［7］。Tserang等［8］在四川金川縣牦牛群體調(diào)查統(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn)，多肋牦牛的個(gè)體占群體總數(shù)的52 %，并且該多肋牦牛群體的繁殖率和生產(chǎn)性能都明顯比非多肋牦牛的偏高。

目前，對于HOXC10在牦牛上的研究還很少，主要集中在其影響動物體軸發(fā)育、肢體調(diào)控方面［9］。鑒于HOX基因是動物軀干發(fā)育的框架設(shè)計(jì)基因，對DNA的合成和轉(zhuǎn)錄起關(guān)鍵性作用，每個(gè)HOX基因都有特定的表達(dá)域，共同調(diào)控機(jī)體發(fā)育［10］。本研究通過對金川多肋牦牛HOXC10克隆，對其基因序列進(jìn)行生物學(xué)分析，旨在為下一步解釋該基因?qū)﹃笈ＩL發(fā)育及胚胎骨骼發(fā)育等的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

牦牛組織樣品，采自四川省阿壩州金川縣的多肋牦牛。液氮保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩rizol試劑購自Invitrogen（上海）公司，反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自Ferments公司；Taq DNA聚合酶購自天根生化科技有限公司；DNA片段凝膠回收純化試劑盒購自Axygen公司；pMD19-T克隆載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織RNA的提取和cDNA的合成 采用Trizol法提取牦牛心、肝、肺、腎、大腸、小腸、胃、肌肉、乳腺、卵巢、子宮、輸卵管的總RNA，并用Nanodrop ND-1000（LabTech，USA）檢測RNA的濃度和質(zhì)量，-80℃保存?zhèn)溆?。按照Ferments公司的反轉(zhuǎn)錄酶說明書，采用20 μL體系：1 μL Oligo（dT）18primer，5×Reaction Buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor（20 g/L）1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase（200 g/L）1 μL，模板2 μg，最后用無RNA酶水補(bǔ)足至20 μL，反轉(zhuǎn)錄程序：42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成第一鏈cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中綿羊（登錄號為XM_004006284.1）HOXC10基因的CDS區(qū)序列，采用Premier Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對PCR引物：MF1：5'-CCTCCGCTGTAGTATTGCTC-3'，MR1：5'-GAAGATGCGTCCACCTAAAG-3'，所處位置分別為71-91、1 322-1 342，預(yù)期產(chǎn)物長度1 272 bp，退火溫度為55℃，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.3 目的基因的克隆 以牦牛卵巢組織cDNA為模板，引物為HOXC10的F、R，PCR擴(kuò)增體系為25 μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，用Axygen的凝膠回收試劑盒回收純化的PCR產(chǎn)物，取適量純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在Amp+的瓊脂平板上涂菌。挑取單個(gè)菌落連接于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基。經(jīng)過PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送往Invitrogen（上海）公司進(jìn)行測序。

1.2.4 目的基因序列分析 擴(kuò)增的牦牛HOXC10基因編碼區(qū)序列，采用ORF Finder在線程序預(yù)測開放閱讀框；利用ExPASy網(wǎng)站的在線工具Protparam和ProtScale分析牦牛HOXC10基因編碼蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)和疏水性質(zhì)；利用Interpro在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)；利用DNAstar軟件對克隆得到的牦牛HOXC10編碼區(qū)與NCBI基因

庫中綿羊、黑猩猩等其他動物進(jìn)行同源性比對，并用MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

以牦牛卵巢組織為模板，克隆得到了HOXC10基因。結(jié)果（圖1）顯示，擴(kuò)增片段大小在1 270 bp左右，與預(yù)測擴(kuò)增片段大小基本相符，初步證明克隆成功。分析發(fā)現(xiàn)該序列包含一個(gè)1 029 bp的開放閱讀框，預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量約為 38.2 kD，該蛋白序列中含有43個(gè)帶有負(fù)電的氨基酸殘基，47個(gè)氨基酸帶有正電荷正電荷，理論等電點(diǎn)是8.45。

圖1 金川多肋牦牛HOXC10基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 HOXC10基因的組織表達(dá)分析

以金川多肋牦牛的肝臟、子宮、小腸、輸卵管、肺臟、大腸、乳腺、胃、肌肉、卵巢、心臟、腎臟組織為材料，提取總RNA，通過RT-PCR方法檢測HOXC10在不同組織中表達(dá)量。結(jié)果表明，在金川多肋牦牛的12個(gè)組織中均有HOXC10基因的表達(dá)，其中在肝臟、子宮、小腸中的表達(dá)量相對較高，在輸卵管、胃、肌肉中的表達(dá)量相對較低（圖2）。

圖2 HOXC10基因的組織表達(dá)譜

2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測

2.3.1 牦牛HOXC10基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測 利用Interpro在線工具對牦牛HOXC10基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果（圖3）表明，該序列在第241-330位氨基酸之間具有完整的DNA-binding domain功能域。

2.3.2 牦牛HOXC10基因編碼蛋白質(zhì)親水性/疏水性分析 運(yùn)用ExPASy中的ProScale子程序?qū)OXC10的親疏水性進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4）顯示，根據(jù)氨基酸親水性/疏水性規(guī)律分析，分值越低的親水性越強(qiáng)，分值越高的疏水性越強(qiáng)。由圖4可以看出，牦牛HOXC10的C端0-50個(gè)氨基酸區(qū)域處有一個(gè)明顯的疏水區(qū)域，最大值為1.06（第45位氨基酸），最小值為-2.5（第230位氨基酸），在40-50位氨基酸區(qū)域很可能是HOXC10蛋白的跨膜區(qū)域。

2.3.3 牦牛HOXC10蛋白分子跨膜區(qū)預(yù)測 利用在線分析程序TMpred對HOXC10蛋白質(zhì)跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（圖5）顯示，該蛋白在0-50個(gè)氨基酸處有一個(gè)典型跨膜區(qū)段，結(jié)合親/疏水性的預(yù)測結(jié)果，可以判定此處是HOXC10蛋白的跨膜區(qū)域。

圖3 HOXC10蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析

2.4 金川多肋牦牛HOXC10同源性分析

利用DNAStar軟件程序MegAlign的Clustal W方法與GenBank公布的部分物種HOXC10基因進(jìn)行同源性比較。結(jié)果（圖6）顯示，牦牛與黃牛、綿羊、貓、野豬、人同源性較高，分別為93.2%、97.8%、97.9%、96.1%和95.5%，與原雞、爪蟾的同源性較低，分別為68.7%和63.3%，說明牦牛HOXC10基因在長期進(jìn)化中較為保守，尤其在哺乳動物間具有較高保守性。

2.5 牦牛HOXC10的系統(tǒng)進(jìn)化分析

用MEGA.5軟件的Neighbor-Joining法，將獲得的11條HOXC10基因序列構(gòu)建Btstrap的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖7）顯示，牦牛與黃牛的親緣關(guān)系最近，并與家綿羊、野豬、貓、馬、人、黑猩猩、家鼠形

成哺乳動物的一個(gè)分支，與原雞和爪蟾形成一個(gè)與牦牛較遠(yuǎn)的分支。

圖4 HOXC10蛋白質(zhì)的親疏水性分析

圖5 HOXC10蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析

圖6 金川多肋牦牛HOXC10基因的同源性分析

3 討論

同源盒（Homeobox）基因是一類在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄過程中的主控基因，含有共同的183個(gè)核苷酸序列（同源盒）編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因［11］，這些基因在生物進(jìn)化中具有高度的保守性，暗示了它們在生物發(fā)育過程中扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)脊椎動物HOX基因簇隨著基因組的兩次復(fù)制產(chǎn)生4個(gè)HOX基因簇，首先是由HOXA復(fù)制出HOXB，再由這兩個(gè)簇復(fù)制出HOXC和HOXD，因此，人和哺乳類具有4個(gè)連鎖群，分別命名為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD，這4個(gè)連鎖群分別位于4條染色體上，每個(gè)連鎖群具有大約13個(gè)HOX基因［12］。其中，HOX1-3主要在頭部枕骨區(qū)表達(dá)，HOX4-6在頸椎區(qū)表達(dá)（包括第一胸椎），HOX7-9在胸腰區(qū)高表達(dá)，HOX10-11在腰薦區(qū)表達(dá)，HOX12-13表達(dá)于薦尾區(qū)［13］。脊椎動物HOX基因主要在于調(diào)控胚胎前后體軸和體節(jié)的分化。作為HOX家族的一員，HOXC10基因被證明與動物體節(jié)最后的發(fā)育存在緊密的聯(lián)系［14］，即控制著成骨細(xì)胞的分化、骨骼發(fā)生及肢體的發(fā)育。

圖7 基于HOXC10基因序列構(gòu)建的牦牛與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹

目前，HOX基因是一個(gè)比較熱門的研究領(lǐng)域，對HOX的研究主要集中在胚胎及骨骼發(fā)育方面，但在各組織中的表達(dá)和功能關(guān)系還未做深入研究［15］。而HOX基因的突變和異常將會使他所調(diào)控的區(qū)域發(fā)生畸形［16］。本試驗(yàn)成功克隆了HOXC10基因并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，初步分析了金川多肋牦牛HOXC10基因所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，為下一步探究HOXC10在調(diào)控多肋牦牛肋骨發(fā)育上的功能奠定了理論基礎(chǔ)?；蛲葱员葘Y(jié)果顯示多肋牦牛HOXC10基因與其它物種具有較高的同源性，暗示了HOXC10基因在調(diào)控動物發(fā)育過程中的重要性；另外，本試驗(yàn)成功分析了HOXC10基因的表達(dá)

譜，組織表達(dá)分析結(jié)果表明HOXC10在牦牛大部分組織中都有表達(dá)，尤其在肝臟、子宮中的表達(dá)量較高，這與小鼠胚胎中表達(dá)譜結(jié)果基本一致［17］?；蛟诓煌M織中的表達(dá)量水平直接與其功能相關(guān)［18］，HOXC10基因在組織中的差異表達(dá)與功能的關(guān)聯(lián)分析將是下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。此外，由于環(huán)境的顯著差異性，推測基因的差異很可能存在于基因編碼區(qū)以外的區(qū)域，如啟動子區(qū)域的甲基化水平的程度往往會導(dǎo)致基因表達(dá)量的差異。

基于以上的研究結(jié)果，初步推測在金川多肋牦牛體節(jié)發(fā)育過程中，HOXC10可能有重要的調(diào)控作用。當(dāng)然，該基因的功能有待在已建立的牦牛的乳腺上皮細(xì)胞系上進(jìn)行驗(yàn)證［19］。后續(xù)試驗(yàn)將對多肋與非多肋牦牛各主要器官HOXC10基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析，以確定HOXC10基因的表達(dá)是否存在明顯差異性，為探索HOXC10基因的更多的分子機(jī)制提供更有力的依據(jù)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆的牦牛HOXC10基因包含一個(gè)1 029 bp的開放閱讀框，編碼342個(gè)氨基酸；該基因所編碼的蛋白屬于親水性蛋白質(zhì)；牦牛與其它物種的HOXC10基因編碼區(qū)序列具有較高的同源性，該基因在生物進(jìn)化上高度保守；進(jìn)化結(jié)果顯示，牦牛與黃牛的親緣關(guān)系最近。本研究分析序列和蛋白時(shí)，選用多種軟件，提高了結(jié)果的可靠性。

［1］Krumlaufr. HOX genes in vertebrate development［J］. Cell, 1994, 78（2）：191-201.

［2］Thorsteinsdottir U, Sauvageau G, Hough MR, et al. Overexpression of HOXA10 in murine hematopoietic cells perturbs both myeloid and lymphoid differentiation and leads to acute myeloid leukemia［J］. Mol Cell Biol, 1997, 17（1）：495-505.

［3］Carlson MR, Komine Y, Bryant SV, et al. Expression of Hoxb13 and Hoxc10 in developing and regenerating axolotl limbs and tails［J］. Dev Biolo, 2001, 229：396-406.

［4］Christen B, Beck CW, Lombardo A, et al. Regeneration-specific expression pattern of three posterior Hox genes［J］. Dev Dyn, 2003, 226：349-355.

［5］林亞秋, 張倡琿, 鄭玉才, 等. 九龍牦牛肌細(xì)胞生成素基因的克隆及其表達(dá)譜［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 45（2）：207-211.

［6］Wiener G, Han JL, Long RJ. The Yak［M］. 2nd edition. FAO, 2003.

［7］高川, 熊顯榮, 李宇, 等. Scriptaid處理牦牛成纖維細(xì)胞對組蛋白乙酰化及重編程的影響［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 21（1）：62-68.

［8］趙靜, 張立嶺, 陳琦, 等.蒙古羊HOXC8基因甲基化與胸椎數(shù)量的關(guān)系［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī), 2011, 5：11-14.

［9］周曉寧, 方美霞, 何小梅, 等.豬繁殖候選基因HOXA10的克隆及表達(dá)分析［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2011, 37（1）：60-64.

［10］Christians ES, Yan LJ, Benjamin IJ. Heat shock factor 1 and heat shock proteins：critical partners in protection against acute cell injury［J］. Critical Care Med, 2002, 30（1）：S43-S50.

［11］Lewis EB. Clusters of master control genes regulate the development of higher organisms［J］. JAM, 1992, 267（11）：1524-1531.

［12］Ferrier DEK. HOX genes：Did the vertebrate ancestor have a HOX14?［J］. Current Biology, 2004, 14：210-211.

［13］Samuel S, Naora H. Homeobox gene expression in cancer：insights from developmental regulation and deregulation［J］. Eur J Cancer, 2005, 41：24-28.

［14］陳紹軍.無蹼壁虎尾的形態(tài)結(jié)構(gòu)與其自截?cái)辔埠蛿辔不顒拥难芯浚跩］.中藥材, 1992, 15（11）：10-13.

［15］李宇, 熊顯榮, 蘭道亮, 等.麥洼牦牛HOXA10基因的克隆、原核表達(dá)及組織表達(dá)譜［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 22（7）：7-11.

［16］Chernoff EA, Stocum DL, Nye HL, et al. Urodele spinal cord regeneration and related processes［J］. Dev Dyn, 2003, 226：295-307.

［17］鄭艷軍. HOXC8在小鼠成骨細(xì)胞分化中的調(diào)控用作研究［D］.長春：吉林大學(xué), 2009.

［18］Blitek A, Kaczmarek MM, Kiewisz J, et al. Endometrialand conceptus expression of HOXA10, transforming growth factor beta1, leukemia inhibitory factor, andprostaglandin H synthase-2 in early pregnant pigs with gonadotropin-induced estrus［J］. Domest Anim Endocrinol, 2010, 38（4）：222-234.

［19］符梅, 熊顯榮, 高川, 等.麥洼牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性［J］.西北農(nóng)業(yè)校報(bào), 2012, 21（11）：8-13.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning，Sequence and Tissue Expression Pattern Analysis of HOXC10 Gene in Multi-costa Properties Yaks of Jinchuan

Zhang Yanan1Xiong Xianrong1Lan Daoliang1Fu Mei1Zhang Yan1Hou Dingchao2Ma Dingmei2Li Shanrong2Li Jian1
（1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041；2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Jinchuan County, Jinchuan 624100）

The present study aimed at cloning yak HOXC10 gene, and further analysis of the gene structure and function, and reveals the tissue specificity expression pattern. The Jinchuan multi-costa properties yak as materials, this study based on the GenBank published Ovis aries HOXC10 gene sequences for primier designing, using RT-PCR technology to amplification the cDNA full length of HOXC10 gene, and its bioinformatic analysis and expression profiling in various tissues. The sequencing result showed that the length of yak HOXC10 gene is 1 272 bp and contains a 1 029 bp open reading frame（ORF）, encoding 342 amino acids. The results of homology analysis showed that yak and bos taurus has the higher similarity（93.2%）；Followed by predicting HOXC10 protein molecular weight 38.2 kD, the theory of isoelectric point is 8.45. Evolutionary tree analysis results showed that yak was closest relative with bos taurus, and in the same branch. Tissue expression profile analysis showed that HOXC10 gene is expressed in different degrees in various organizations, which had the highest expression in the liver, the lowest expression in the stomach.

Yak Cloning HOXC10 Sequence analysis Tissue expression

2014-04-22

國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD13B06），國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)（201203009），西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新性項(xiàng)目（CX-2014SZ72）

張亞南，女，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞與胚胎工程；E-mail：yanan599302927@126.com

李鍵，男，博士，教授，研究方向：動物生殖調(diào)控；E-mail：lijian@swun.cn