黃春玲，鄧 寒，柯雪娥，韓霜雪，何曉陽(yáng)

（深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1．深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2．深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

雌激素樣化合物對(duì)人細(xì)胞色素氧化酶2A6基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

黃春玲1，鄧 寒1，柯雪娥2，韓霜雪2，何曉陽(yáng)1

（深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1．深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2．深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

目的建立尼古丁代謝酶CYP2A6報(bào)告基因高容量篩選系統(tǒng)，分析環(huán)境和天然雌激素樣化合物對(duì)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄的影響。方法構(gòu)建3種CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄上游－2460～＋1全長(zhǎng)、增強(qiáng)子-啟動(dòng)子串聯(lián)和3倍增強(qiáng)子-啟動(dòng)子串聯(lián)的熒光素酶報(bào)告基因重組體pGL3-2A6 3UP，GL3-2A6 EP和pGL3-2A6 3EP，分別與雌激素受體α（ERα）及海腎熒光蛋白表達(dá)載體三重共轉(zhuǎn)染人肝HepG2細(xì)胞。用雙熒光素酶報(bào)告基因分析技術(shù)，選擇確認(rèn)對(duì)雌二醇誘導(dǎo)應(yīng)答最強(qiáng)的CYP2A6報(bào)告基因系統(tǒng)；分別用氰戊菊酯、2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚、4-二羥基二苯基丙烷、全氟辛酸銨、淫羊藿苷、大豆苷元和槲皮素等7種擬雌激素化合物處理轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置雌二醇10 nmol·L－1陽(yáng)性和0．1%DMSO陰性對(duì)照，48 h后測(cè)定各組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度，分析評(píng)估擬雌激素物質(zhì)對(duì)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用。結(jié)果3種CYP2A6報(bào)告基因重組體中pGL3-2A6 3EP對(duì)雌二醇誘導(dǎo)應(yīng)答最強(qiáng)，且呈顯著量效依賴關(guān)系。7種擬雌激素化合物對(duì)CYP2A6報(bào)告基因均具顯著誘導(dǎo)作用，其中，2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚1．0～100．0 nm ol·L－1誘導(dǎo)倍變值為1．45±0．13～3．30±0．13（P＜0．01），誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)。表現(xiàn)出相似的量效誘導(dǎo)關(guān)系，淫羊藿苷、大豆苷元和槲皮素10μmol·L－1時(shí)的誘導(dǎo)倍變值為2．41～2．83（P＜0．01）。結(jié)論建立靈敏可靠、重復(fù)性強(qiáng)的CYP2A6報(bào)告基因高容量篩選系統(tǒng)，證實(shí)多種擬雌激素物質(zhì)通過激活ERα誘導(dǎo)CYP2A6報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。提示環(huán)境擬雌激素污染物和藥材食材雌激素樣活性物質(zhì)可誘導(dǎo)個(gè)體尼古丁代謝酶基因表達(dá)，從而干擾個(gè)體尼古丁代謝清除活性及其對(duì)環(huán)境化合物致癌代謝活化水平。

細(xì)胞色素P450 CYP2A6；轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控；擬雌激素化合物

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2013．06．014

肝的細(xì)胞色素氧化酶2A6（cytochrome P450 2A6，CYP2A6）是人體主要的尼古丁代謝酶，承擔(dān)＞80%尼古丁的代謝清除。此外，它還可催化尼古丁與4-（甲基亞硝胺基）-1-（3-吡啶）-1-丁酮〔4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone，NNK）之間的生物轉(zhuǎn)化［1］，并可致癌代謝活化NNK、微生物污染物黃曲霉素（aflatoxin B1，AFB1）等多種環(huán)境致癌原［2－3］。CYP2A6的這種雙重代謝作用，使其成為評(píng)估個(gè)體尼古丁耐受成癮、吸煙行為以及環(huán)境暴露與癌癥易感性關(guān)系的重要生物學(xué)標(biāo)志。分子流行病學(xué)研究顯示，個(gè)體尼古丁酶代謝活性具有顯著性別差異，尼古丁快代謝人群一般對(duì)煙草及環(huán)境致癌原物質(zhì)的致癌代謝活化水平增大，罹癌風(fēng)險(xiǎn)增高［3］。女性尼古丁代謝清除速率一般比男性高，且口服含有雌激素避孕藥的女性和孕期婦女，其尼古丁清除明顯加快，CYP2A6肝外組織表達(dá)水平在乳腺和卵巢中較高［4－5］。提示CYP2A6基因表達(dá)可能受到性激素調(diào)控。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在具有雌激素受體α（estrogen receptor-α，ERα）的乳腺癌MCF7細(xì)胞中，包括CYP2A6在內(nèi)的一些致癌原活化代謝基因的表達(dá)顯著上調(diào)，而ERα陰性的乳腺癌細(xì)胞則無(wú)明顯改變［4］。日本學(xué)者在2007年發(fā)現(xiàn)，CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄上游調(diào)控序列－2500～－2300區(qū)間存在與保守的雌激素反應(yīng)元件（estrogen response elem ent，ERE）高度同源的序列（簡(jiǎn)稱為ERE-like），并證實(shí)雌二醇（estradiol，E2）通過核受體ERα介導(dǎo)而明顯上調(diào)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄［6］。

我國(guó)主動(dòng)吸煙人口有3億，被動(dòng)吸煙人口5億，且被動(dòng)吸煙人口以婦女和兒童為主，而我國(guó)又同時(shí)是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥、塑料制品及家用電器生產(chǎn)使用大國(guó)，存在著比較廣泛的環(huán)境擬雌激素化合物殘留，常見的包括殺蟲農(nóng)藥氰戊菊酯（fenvalerate，F(xiàn)EN）、電器阻燃劑2，2′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚（2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether，BDE-47）、塑料添加劑4-二羥基二苯基丙烷（又稱雙酚A，bisphenol A，BPA）和全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）等。這些擬雌激素物質(zhì)在土壤、水源及果蔬中的殘留超標(biāo)情況十分普遍，其低劑量、長(zhǎng)時(shí)間暴露是普通人群的一個(gè)重要特征［7－9］。此外，我國(guó)保有自行食補(bǔ)和藥補(bǔ)的生活習(xí)慣，食物和中草藥材中常含有的一些天然活性成分如大豆苷元（daidzein，DAI）、槲皮素（quercetin，QUE）和淫羊藿苷（icariin，ICA）都被證明具有雌激素樣生物活性。因此，研究我國(guó)常見環(huán)境擬雌激素和植物源雌激素樣活性物質(zhì)對(duì)CYP2A6基因表達(dá)的影響及其分子機(jī)制，對(duì)于闡明吸煙相關(guān)環(huán)境、基因與罹癌風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系具有重要理論與實(shí)踐意義。因此，本研究旨在通過建立靈敏可靠和重復(fù)性強(qiáng)的CYP2A6報(bào)告基因高容量篩選系統(tǒng)，以E2為陽(yáng)性對(duì)照，分析評(píng)估上述7種雌激素樣化合物對(duì)人CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，并探索其分子機(jī)制，為國(guó)家控?zé)熀驮u(píng)價(jià)環(huán)境污染與健康風(fēng)險(xiǎn)等公共衛(wèi)生領(lǐng)域重大問題提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑和儀器

熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3-Basic、海腎紅色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pRL-TK（內(nèi)參）和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒均質(zhì)購(gòu)自Promega公司；pcDNA3．0-ERα質(zhì)粒由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張琚教授饋贈(zèng)。Lipofectamine2000和Platinum?Taq DNA聚合酶購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。人肝癌細(xì)胞株HepG2（ATCC-HB-8065，Manassas，美國(guó)）細(xì)胞來(lái)自深圳市疾病預(yù)防控制中心。E2，F(xiàn)EN，BDE-47，BPA和PFOA購(gòu)自Sigm a公司；ICA，DAI和QUE購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?；瘜W(xué)發(fā)光儀購(gòu)自賽默飛（中國(guó)）公司。

1．2CYP2A6報(bào)告基因重組體構(gòu)建

根據(jù)GenBank人CYP2A6基因序列（NG＿000008．5）設(shè)計(jì)引物，并引入需要的酶切位點(diǎn)，由深圳華大基因公司合成。擴(kuò)增上游－2460～＋1全長(zhǎng)序列的引物對(duì)為2A6-2500 F：5′-CTCGAGGGTGGTAGTGGGATGATAGA-3′，2A6-2500 R：5′-AAGCTTTCATTGACCTCTATGTCCACAAAT-3′；擴(kuò)增－2460～－2363含ERE同源序列的增強(qiáng)子片段引物對(duì)為2A6-E F：5′-CTCGAGGGTGGTAGTGGGATGATAGA-3′，2A6-E R：5′-GGATCCGAGGCCCCCTCTCTGTTC-3′；擴(kuò)增－205～＋1啟動(dòng)子序列引物對(duì)為2A6-P F：5′-AGATCTTGTTTCTCACTGGGGTTGG-3′，2A6-P R：5′-AAGCTTTCATTGACCTCTATGTCCACAAAT-3′。以人肝細(xì)胞染色體DNA為模板，用Platinum?Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR，特異性地?cái)U(kuò)增CYP2A6基因上游約2500 bp序列全長(zhǎng)。PCR條件為94℃3 m in活化后，94℃變性30 s、64℃退火30 s、72℃延伸2．5 m in，循環(huán)30次，72℃延伸10 m in。用pMD?20-T載體，按產(chǎn)品說(shuō)明書操作，保存、中轉(zhuǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并測(cè)序確認(rèn)序列完全與GenBank收載序列一致。利用HindⅢ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，將目的基因插入pGL3-Basic載體，構(gòu)建成CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄上游全序列報(bào)告基因重組體pGL3-2A6 UP。以pGL3-2A6UP-Luc質(zhì)粒為模板，分別PCR擴(kuò)增增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列，并構(gòu)建增強(qiáng)子-啟動(dòng)子串聯(lián)的CYP2A6報(bào)告子pGL3-2A6EP重組載體，測(cè)序確認(rèn)序列正確；進(jìn)一步通過酶切位點(diǎn)的拼接，構(gòu)建成3×ERE-啟動(dòng)子串聯(lián)的報(bào)告子pGL3-2A6 3EP。

1．3 細(xì)胞培養(yǎng)、三重重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG細(xì)胞與雌二醇誘導(dǎo)

提前24 h以每孔0．05×106HepG2細(xì)胞的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用含10%FBS的RPM I 1640完全培養(yǎng)基，5%CO2，37℃條件常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度為60%～70%時(shí)，用Lipofectamine 2000按產(chǎn)品使用指南操作，介導(dǎo)報(bào)告子、核受體和內(nèi)參質(zhì)粒的三重共轉(zhuǎn)染。CYP2A6報(bào)告子pGL3-2A6 UP，pGL3-2A6EP和pGL3-2A6 3EP分別與PCDNA3．0-ERα和PRL-TK三重共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24 h后，用含E210 nmol·L－1的完全培養(yǎng)液置換舊培養(yǎng)液，常規(guī)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，24 h時(shí)換新鮮E2培養(yǎng)液1次，培養(yǎng)至48 h。平行設(shè)置含0．1%DMSO常規(guī)培養(yǎng)液處理的陰性對(duì)照組。

1．4 細(xì)胞裂解液相對(duì)熒光強(qiáng)度測(cè)定

上述共轉(zhuǎn)染報(bào)告基因并進(jìn)行誘導(dǎo)處理后的HepG2細(xì)胞，吸棄上層培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，按照Promega公司的Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System試劑盒使用說(shuō)明書，每孔加入1×PLB細(xì)胞裂解液100μL，室溫下充分裂解。裂解液用化學(xué)發(fā)光儀分別測(cè)定螢火蟲熒光素酶的黃色熒光強(qiáng)度和海腎熒光素酶的紅色熒光強(qiáng)度，并以后者為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，以樣品相對(duì)熒光強(qiáng)度表示各樣品CYP2A6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。

1．5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

選擇對(duì)E2誘導(dǎo)應(yīng)答最強(qiáng)的報(bào)告基因，按1．4所述方法，在24孔培養(yǎng)板上，按照每孔0．05×106細(xì)胞轉(zhuǎn)染報(bào)告子、核受體和內(nèi)參質(zhì)粒DNA分別為：50／0／2 ng，20／20／2 ng，40／10／2ng，30／30／2 ng，40／20／2 ng和40／40／2 ng 6種不同濃度和比例，進(jìn)行三重重組體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24 h后再用E210 nmol·L－1處理細(xì)胞48 h，測(cè)定細(xì)胞裂解液相對(duì)熒光強(qiáng)度，確認(rèn)對(duì)E2誘導(dǎo)響應(yīng)最強(qiáng)的轉(zhuǎn)染條件為最適轉(zhuǎn)染條件，并保持在該轉(zhuǎn)染條件下，檢測(cè)CYP2A6報(bào)告基因分析體系對(duì)E20～10 nmol·L－1處理的誘導(dǎo)應(yīng)答量效關(guān)系；進(jìn)一步分析7種擬雌激素的誘導(dǎo)效應(yīng)。

1．6 擬雌激素化合物對(duì)CYP2A6報(bào)告基因的誘導(dǎo)作用

分別用含BDE-47 0．1，10．0和100．0 nmol·L－1，F(xiàn)EN 0．05，0．5和5．0μm o l·L－1，BPA或PFOA 1．0，10．0和100．0μm o l·L－1，以及DAI或QUE或ICA 0．01，0．1，1．0和10．0μmol·L－1的完全培養(yǎng)液處理轉(zhuǎn)染CYP2A6報(bào)告基因的HepG2細(xì)胞48 h，按前文所述方法測(cè)定各種處理?xiàng)l件下細(xì)胞裂解液樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度。平行設(shè)置0．1%DMSO處理細(xì)胞為陰性對(duì)照，E210 nmol·L－1處理細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。

以上所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，獨(dú)立操作，每次實(shí)驗(yàn)均平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 三種CYP2A6熒光素酶報(bào)告基因重組體構(gòu)建

以人肝細(xì)胞染色體DNA為模板，用CYP2A6 UP F／R引物和高保真DNA聚合酶，PCR特異性擴(kuò)增出約2500 bp長(zhǎng)度的目的基因條帶，1%凝膠電泳檢測(cè)如圖1A所示。將該P(yáng)CR產(chǎn)物連接于pMD?20-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序，確認(rèn)獲得序列正確的目的DNA片段。在此基礎(chǔ)上分別用2A6E-F／R引物和2A6PF／R引物，PCR擴(kuò)增獲得含ERE-like、～150 bp增強(qiáng)子序列和～200 bp啟動(dòng)子序列，2%凝膠電泳檢查結(jié)果見圖1B，經(jīng)過T-載體中轉(zhuǎn)、測(cè)序正確。亞克隆分別將CYP2A6基因上游序列全長(zhǎng)、5′→3′順序增強(qiáng)子-啟動(dòng)子串聯(lián)體和3×增強(qiáng)子-啟動(dòng)子串聯(lián)體連接進(jìn)入pGL3-pGL3-Basic表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選培養(yǎng)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒DNA，用HindⅢ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切消化，凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，3種質(zhì)粒酶切后分別釋放出～2500 bp，～400 bp和～600 bp的插入片段及～5000 bp的載體片段，長(zhǎng)度符合預(yù)期，表明3種報(bào)告基因重組體均構(gòu)建成功，分別命名為pGL3-2A6 UP，pGL3-2A6 EP和pGL3-2A6 3EP，用于后續(xù)研究。

Fig．1 Electrophoresis analysis of PCR products of CYP2A6 gene 5′-franking region．A：M，DL5000 marker；lane 1，CYP2A6 gene upstream－2460～＋1 sequence．B：M，DL2000 marker；lanes 1－2，CYP2A6 gene potential enhancer region－2363～－2460 sequence，which containing the estrogen response element（ERE）；lanes 3－4，CYP2A6 gene－205～＋1 promoter sequence．

2．2 三種報(bào)告基因?qū)Υ贫嫉恼T導(dǎo)應(yīng)答

圖3結(jié)果顯示，各報(bào)告基因均對(duì)E2顯示出誘導(dǎo)應(yīng)答，相較DMSO處理細(xì)胞，誘導(dǎo)倍數(shù)在1．5～4倍范圍。但比較相對(duì)熒光強(qiáng)度可見，全序列的pGL3-2A6 UP對(duì)E2誘導(dǎo)響應(yīng)最低，pGL3-2A6 EP次之，pGL3-2A6 3EP最高。說(shuō)明自然狀態(tài)的CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列在體外可呈現(xiàn)對(duì)雌激素的誘導(dǎo)應(yīng)答，但是強(qiáng)度較低，不宜作為篩選評(píng)估擬雌激素誘導(dǎo)作用的分析系統(tǒng)。刪除增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間可能的衰減子序列或增加ERE-like元件的數(shù)目，均可以增強(qiáng)CYP2A6報(bào)告基因體系對(duì)雌激素的誘導(dǎo)應(yīng)答。因此，本研究選擇誘導(dǎo)應(yīng)答最強(qiáng)的pGL3-2A6 3EP報(bào)告子，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化和建構(gòu)高容量篩選體系的研究，并進(jìn)一步評(píng)估擬雌激素物質(zhì)對(duì)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。

Fig．3 Relative trancriptional activities of three CYP2A6 luciferase reporter constructs under estradiol treatment and co-expression of estrogen receptor-α（ERα）in HepG2 cells．Schematic representation of the luciferase reporter constructs is on the left．Reporter construct containing the CYP2A6 gene－2460～＋1 region（pGL3-2A6 UP），or the potential enhancer region host estrogen response elem ent（ERE）-like tandem in the 5′of promoter（pGL3-2A6 EP），or three copies of this ERE-like tandem in the 5′of promoter（pGL3－2A6 3EP），was transfected into HepG2 cells with pcDNA3．0-ERαand pRL-TK．After 24 h，the cells were treated with estradiol E210 nmol·L－1or 0．1%DMSO for 48 h．Activities of firefly luciferase in cell lysates were normalized to those of cotransfected Renilla reniformis（RR）luciferase．，n＝3．**P＜0．01，compared with DMSO treatment．

2．3 最適細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的篩選

E2對(duì)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用，已確認(rèn)為通過結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)中的ERα使之發(fā)生構(gòu)象改變和核位移，形成同二聚體結(jié)合于基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域中ERE元件同源序列而上調(diào)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄水平［8］。建立可以實(shí)際應(yīng)用的CYP2A6報(bào)告基因高容量篩選體系，必須靈敏、穩(wěn)定和重現(xiàn)性好。因此，需要考察細(xì)胞共轉(zhuǎn)染報(bào)告子與核受體ERα的最適濃度與比例，以獲得對(duì)誘導(dǎo)劑穩(wěn)定和高效的誘導(dǎo)應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖4），CYP2A6報(bào)告基因與核受體ERαDNA的轉(zhuǎn)染濃度與比例極大地影響報(bào)告基因體系對(duì)E2的誘導(dǎo)應(yīng)答強(qiáng)度。當(dāng)報(bào)告子與核受體DNA轉(zhuǎn)染的用量與比例為50 ng∶0 ng時(shí)，E2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度值較小，誘導(dǎo)倍變值亦最低，僅為DMSO對(duì)照組的1．5倍左右，表明細(xì)胞內(nèi)源性ERα不足以靈敏介導(dǎo)雌激素的基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)效應(yīng)。而共轉(zhuǎn)染CYP2A 6報(bào)告子和核受體ER重組DNA時(shí)，報(bào)告基因體系的誘導(dǎo)倍變值均明顯提升至2倍以上。其中，轉(zhuǎn)染重組 DNA pGL3-2A6 3EP∶pCDNA3．0-ERα為40 ng∶20 ng時(shí)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)E2的誘導(dǎo)應(yīng)答靈敏且穩(wěn)定，各次實(shí)驗(yàn)的相對(duì)熒光值均在10～100范圍，誘導(dǎo)倍變值則穩(wěn)定在3～4倍范圍，重現(xiàn)性良好。因此，確認(rèn)該轉(zhuǎn)染濃度和比例為最適報(bào)告基因轉(zhuǎn)染條件，并在此轉(zhuǎn)染條件下進(jìn)行后續(xù)擬雌激素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。

Fig．4 Effect of reporter／receptor DNA transfection concentration on induction response in CYP2A6 reporter luciferase activity．Different concentrations of reporter plasmid pGL3-2A6 3EP were transfected into HepG2 cells with or without ERαexpression for 24 h and then treated with E210 nmo·lL－1for 48 h．Relative luciferase activities and fold induction data represent three independent experiments．1－6：Reporter∶receptors were 50 ng∶0 ng，20 ng∶20 ng，40 ng∶10 ng，30 ng∶30 ng，40 ng∶20 ng and 40 ng∶40 ng，respectively．，n＝3．*P＜0．05，**P＜0．01，compared with DMSO treatment．

2．4 pGL3-2A6 3EP報(bào)告基因分析系統(tǒng)對(duì)雌二醇誘導(dǎo)應(yīng)答的量效關(guān)系

表1結(jié)果表明，在E20～10 nmol·L－1濃度范圍對(duì)CYP2A6報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄具有顯著的量-效依賴性誘導(dǎo)作用，E210 nm o l·L－1處理細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性是DMSO處理細(xì)胞的（3．91±0．36）倍。該結(jié)果與前述轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化項(xiàng)下結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件下，CYP2A6雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)可應(yīng)用于研究評(píng)估擬雌激素化合物對(duì)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄的影響。

Tab．1 Concentration-dependent induction response of CYP2A6 reporter gene to E2treatment

2．5 環(huán)境擬雌激素對(duì)CYP2A6轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用

4種環(huán)境擬雌激素BDE-47，BPA，PFOA和FEN在本研究濃度范圍，對(duì)CYP2A6報(bào)告基因均具有明顯的誘導(dǎo)作用（表2）。CYP2A6報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)各種擬雌激素化合物的誘導(dǎo)應(yīng)答強(qiáng)度隨濃度從低到高而依次增大，具有顯著的濃度依賴性。在環(huán)境化合物中，BDE-47對(duì)CYP2A6轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)，濃度為100．0 nmol·L－1時(shí)，誘導(dǎo)倍變值達(dá)到3．30±0．13（P＜0．01），幾乎與陽(yáng)性對(duì)照E210 nmo l·L－1的誘導(dǎo)效應(yīng)持平；BPA在1～100μm o l·L－1濃度范圍，誘導(dǎo)CYP2A6報(bào)告基因的效應(yīng)亦穩(wěn)定上升，在100μmol·L－1時(shí)，誘導(dǎo)倍變值達(dá)到1．85±0．15（P＜0．01）；PFOA和FEN總體表現(xiàn)出較弱的誘導(dǎo)效應(yīng)，各實(shí)驗(yàn)濃度下上調(diào)50%左右。需要提及的是，F(xiàn)EN在10μmo l·L－1濃度時(shí)表現(xiàn)一定細(xì)胞毒性，鏡檢可見少量細(xì)胞懸浮，因而調(diào)整最高濃度為5μmol·L－1，此條件下未見細(xì)胞有顯著死亡，但亦未見誘導(dǎo)作用增加。

Tab．2 Concentration-dependent induction of environmental estrogenic compounds on CYP2A6 transcription

2．6 植物擬雌激素對(duì)CYP2A6轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用

Fig．5 lnduction effects of phytoestrogen treatment on CYP2A6 reporter gene luciferase activities．HepG2 cells trancently co-expressing CYP2A6 luciferase reporter gene and ERαwere harvested after phytoestrogen for 48 h．E210 nmol·L－1was used as the positive control．ICA：icarrin；DAI：daidzein；QUE：quercetin．，n＝3．**P＜0．01，compared with 0．1%DMSO treatment（0μmol·L－1）．

3種天然雌激素樣活性物質(zhì)ICA，DAI和QUE在0～10μmol·L－1范圍內(nèi)均表現(xiàn)相似的濃度依賴性CYP2A6報(bào)告基因誘導(dǎo)作用（圖5）：在0．1μmo l·L－1濃度，開始表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)效應(yīng)（提高接近200%），而10μm ol·L－1時(shí)，誘導(dǎo)CYP2A6報(bào)告基因相對(duì)熒光強(qiáng)度上升2．41～2．83倍（P＜0．01）。提示環(huán)境化合物和天然雌激素樣活性物質(zhì)可能對(duì)人體尼古丁代謝酶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生干擾作用，但其產(chǎn)生效應(yīng)濃度遠(yuǎn)較E2高，有必要進(jìn)一步進(jìn)行深入細(xì)致的研究。

3 討論

CYP2A6表達(dá)的組織特異性、個(gè)體酶活性的性別差異以及癌變組織中表達(dá)改變等，無(wú)不表明其基因表達(dá)除受到基因多態(tài)性的遺傳因素影響外，還受到生理狀況、生活習(xí)慣和環(huán)境暴露等多種因素的影響［10－11］。雖然自2005年以來(lái)，有關(guān)CYP2A6基因表達(dá)調(diào)控的研究報(bào)道開始增多，但目前人們對(duì)相關(guān)的影響因素及其分子機(jī)制仍然知之甚少。

重要的肝CYP家族藥物代謝酶基因轉(zhuǎn)錄除受到肝細(xì)胞核因子4α（hepatic nuclear factor 4 alpha，HNF-4α）調(diào)控外，還主要受到幾種核受體調(diào)控，如利福平和苯巴比妥等藥物主要通過孕烷X受體（pregnane X-recep tor，PXR）介導(dǎo)而顯著誘導(dǎo)CYP3A4等基因轉(zhuǎn)錄；一些神經(jīng)系統(tǒng)藥物及環(huán)境化合物二噁英、三甲膽蒽和萘酚等均可激活芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）而上調(diào)CYP1A1，1A2，和1B1等基因轉(zhuǎn)錄；苯巴比妥、CITCO｛6-（4-chlorophenyl）imidazo［2，1-b］［1，3］thiazole-5-carbaldehyde-O-（3，4-dichlorobenzyl）oxime｝則可以激活組成型雄烷受體（constitutive androstane receptor，CAR）而誘導(dǎo)CYP2B亞家族基因轉(zhuǎn)錄等。然而，上述通用核因子對(duì)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用卻并不明顯。目前已證實(shí)，CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄區(qū)上游－205～＋1 bp為核心啟動(dòng)子序列，存在TATA盒、C／EBP及HNF-4α應(yīng)答元件、CCAAT盒等重要調(diào)控元件［12］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，利福平亦可誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞CYP2A6 mRNA水平增高，并確認(rèn)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄上游遠(yuǎn)端約－7000～－4600 bp區(qū)域存在同向結(jié)合模序DR4相似序列（DR4-like），可與CAR和PXR等結(jié)合，但只有當(dāng)PXR與過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（p ro liferator-activated receptorγ coactivator1α，PGC1）共過表達(dá)時(shí)，利福平才能顯著誘導(dǎo)CYP2A6報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性約4倍［13］。地塞米松也可誘導(dǎo)肝細(xì)胞CYP2A6基因表達(dá)，其機(jī)制為結(jié)合于糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）后入核，通過增強(qiáng)HNF-4α與其啟動(dòng)子區(qū)域的HNF-4α結(jié)合元件的結(jié)合，從而上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄水平［14］。2011年，Naka jim a等［15］報(bào)道，溶血栓及抗氧化藥物蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）可以激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2），與－1193～－1212 bp區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element 1，ARE1）結(jié)合，誘導(dǎo)CYP2A6 mRNA表達(dá)1．4倍，但香豆素代謝酶活性卻增加1．9倍，提示機(jī)體或細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)可影響CYP2A6基因表達(dá)。此后的研究報(bào)道證實(shí)，乙醇經(jīng)CYP2E1代謝而導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激，可激活Nrf2因子，入核后經(jīng)蛋白激酶C／絲裂原活化蛋白激酶激酶通路（protein kinase C／mitogen-activated protein kinase kinase，PKC／MEKK）而誘導(dǎo)U937單核細(xì)胞中CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄提高200%［16］。分析比較上述研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，原代人肝細(xì)胞或一些細(xì)胞系中的CYP2A6轉(zhuǎn)錄受到許多藥物和化合物的影響，但誘導(dǎo)水平卻有限，表現(xiàn)出誘導(dǎo)物較多但誘導(dǎo)效應(yīng)均不高（大多在1．5～3倍之間）以及多重因素綜合效應(yīng)較為明顯等基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控總體特征。本研究結(jié)果顯示，7種擬雌激素化合物都可以不同程度地上調(diào)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)作用肯定但報(bào)告基因誘導(dǎo)倍數(shù)基本＜3倍，再次證實(shí)了這一特征。

Higashi等［6］發(fā)現(xiàn)，在原代肝細(xì)胞和ER高表達(dá)的乳腺M(fèi)CF-7細(xì)胞中，CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄受E2誘導(dǎo)上調(diào)～50%，而在ER陰性的MDA-MB-435細(xì)胞中則不受影響。免疫組化研究結(jié)果顯示，性成熟女性子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中CYP2A6免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度與生理周期相關(guān)，增殖期和早期分泌期CYP2A6水平明顯較晚期分泌期為高。進(jìn)一步的研究證實(shí)，E2激活ERα入核，結(jié)合于CYP2A6基因上游－2500～－2363 bp區(qū)域內(nèi)ERE同源序列，從而誘導(dǎo)CYP2A6基因轉(zhuǎn)錄。該研究表明，CYP2A6可直接以ERα依賴性方式被誘導(dǎo)，揭示了CYP2A6在雌激素應(yīng)答組織中特異性表達(dá)的重要原因。本研究首先是建立肝HepG2細(xì)胞／CYP2A6報(bào)告基因體系，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，使之成為能規(guī)范化操作、重復(fù)性好和可常規(guī)性應(yīng)用于大量化合物篩選評(píng)估的高容量分析系統(tǒng)。應(yīng)用該體系對(duì)以BDE-47和DAI為代表的7種擬雌激素化合物進(jìn)行探索的結(jié)果證實(shí)，這些擬雌激素物質(zhì)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍對(duì)CYP2A6報(bào)告基因均有轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)作用，但效果不一，其中最引人矚目的是BED-47。在BED-47 10 nm o l·L－1時(shí)，其對(duì)CYP2A6報(bào)告基因的誘導(dǎo)倍數(shù)約2倍，達(dá)到相同濃度E2誘導(dǎo)強(qiáng)度的50%；而當(dāng)其濃度為100 nmo l·L－1時(shí)，誘導(dǎo)效應(yīng)與E2基本持平。BDE-47是多溴聯(lián)苯醚化合物（polybrominated diphenyl ethers，PBDE）的成員之一。PBDE常被用作阻燃劑添加到塑料、橡膠制品、建筑材料和紡織品等各種潛在可燃材料以及電子電器產(chǎn)品中，它們可通過從基質(zhì)釋放和廢舊材料的回收處理等過程污染環(huán)境，因其在環(huán)境中難降解和具有親脂憎水性，持久性和生物富集成為PBDE的主要環(huán)境污染特征。盡管自2009年起，斯德哥爾摩公約將五溴和八溴聯(lián)苯醚列為新型持久性有機(jī)污染物加以管制，世界各國(guó)陸續(xù)禁止其生產(chǎn)和使用，但在生物樣品和人體組織中檢測(cè)到的PBDE水平仍在不斷上升。我國(guó)廣東貴嶼、清遠(yuǎn)和浙江臺(tái)州等大型電器垃圾拆解場(chǎng)及其周邊環(huán)境以及珠江三角洲和長(zhǎng)江三角洲等經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)空氣、土壤、水體、沉積物、污水處理廠污泥、生物體和人體中PBDE的水平相當(dāng)高，長(zhǎng)江下游水生生物和廣東清遠(yuǎn)地區(qū)的田螺、蝦、魚和水蛇等生物體中PBDE污染較為嚴(yán)重，主要有BDE-47，BDE-100和BDE-154在淡水食物鏈中呈現(xiàn)了生物放大效應(yīng)［6，17－18］。我國(guó)普通人群母乳中PBDE含量在800～11000 pg·g－1脂重之間，平均水平低于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家（可能與飲食中動(dòng)物食品相對(duì)較少有關(guān)），但PBDE153，47和28是檢出濃度最高的主要特征組分［19］。可以認(rèn)為，進(jìn)入環(huán)境中的BDE-47，即便極其微量，由于其極強(qiáng)的長(zhǎng)距離傳輸能力和生物放大作用，也會(huì)在處于食物鏈高位的生物體內(nèi)大量富集，可能引起較為嚴(yán)重的內(nèi)分泌干擾等生理效應(yīng)。本研究結(jié)果不僅跟進(jìn)證實(shí)雌激素和擬雌激素均通過激活ERα作用于基因上游ERE元件而誘導(dǎo)CYP2A6轉(zhuǎn)錄，更為重要的是對(duì)于探索環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物污染與人體尼古丁代謝活性及NNK和AFB1等環(huán)境致癌原的致癌代謝活化關(guān)系提供了有先導(dǎo)性意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

另一方面，本研究檢驗(yàn)的三種食材藥材雌激素樣物質(zhì)亦對(duì)CYP2A6表現(xiàn)出較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，量效關(guān)系基本一致。DAI 0．01～10μm o l·L－1對(duì)CYP2A6報(bào)告基因的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Du等［20］報(bào)道的植物雌激素樣物質(zhì)誘導(dǎo)ER／ERE介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)高度一致，對(duì)CYP2A6報(bào)告基因誘導(dǎo)效應(yīng)最為穩(wěn)定。DAI主要來(lái)源有大豆、紫苜蓿和葛根等，常常在臨床或食補(bǔ)中用于替補(bǔ)防止骨質(zhì)疏松和輔助防治前列腺癌等。QUE是具有廣泛來(lái)源的植物類黃酮，也是銀杏總黃酮醇苷的苷元之一，作為藥品祛痰、止咳、平喘作用和輔助治療冠心病及高血壓等。ICA在傳統(tǒng)補(bǔ)腎強(qiáng)體基礎(chǔ)上廣泛應(yīng)用于增強(qiáng)免疫功能、抗骨質(zhì)疏松、治療心腦血管疾病，近年來(lái)更擴(kuò)展至研究其中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥理作用，應(yīng)用于阿爾茨海默病的干預(yù)治療［21］。因此，我國(guó)普通民眾中因食物習(xí)慣和中藥保健調(diào)理及治療等具有相當(dāng)復(fù)雜多變的植物雌激素樣物質(zhì)攝入范式。本研究初步揭示，這些植物雌激素樣物質(zhì)對(duì)CYP2A6報(bào)告基因具有十分肯定的誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步的細(xì)胞和整體水平的驗(yàn)證則需要后續(xù)工作的深入研究。

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（本文編輯：付良青）

《中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志》中圖片要求

論文中的各種圖片包括病理照片圖、曲線圖、柱圖、電泳圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖等，應(yīng)按以下要求處理。

1．病理照片圖應(yīng)采用加標(biāo)尺的方式表示，并在圖中配上箭頭指示病變區(qū)域（圖1，圖4）。除照片圖外，其他圖均用灰度圖表示。曲線圖圖例依次為○●△▲□■等，圖例字號(hào)為6磅字體為Arial。圖中統(tǒng)計(jì)學(xué)分析符號(hào)標(biāo)注依次為*＃△等。

2．雙欄圖大小為：寬與高的比為3∶2，寬≤7．5 cm，橫、縱坐標(biāo)的字號(hào)為8或9磅字體為Arial；條帶圖上標(biāo)注為：M，1，2，3，4，5等。

3．通欄圖大小為：寬≤15 cm。字號(hào)為9或8榜。橫、縱坐標(biāo)的字號(hào)為8或9磅字體為Aria l。

4．其他有關(guān)圖表自明的要求見本刊網(wǎng)站http：／／www．cjpt．a(chǎn)c．cn下載中心的投稿須知中的第19條和論文模版中的舉例。

lnduction of human cytochrome P450 2A6 transcription by estrogen ic com pounds

HUANG Chun-ling1，DENG Han1，KE Xue-e2，HAN Shuang-xue2，HE Xiao-yang1
（1．Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Eco logy，2．Shenzhen Key Laboratory of Microbia l Genetic Engineering，College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060，China）

OBJECTlVETo develop a CYP2A6 gene transcriptional high-capacity screening system and to evaluate the regulatory effects of four environmental estrogenic compounds and three phytoestrogens on CYP2A6 gene transcription．METHODSThree luciferase reporter plasm ids containing the CYP2A6 gene－2460～＋1 5′-flanking region（pGL3-2A6 UP），the potential enhancer region host estrogen response element（ERE）-like tandem in the 5′of promoter（pGL3-2A6 EP），and three copies of this ERE-like tandem in the 5′o f promoter（pGL3-2A6 3EP）were constructed．Each reporter plasmid DNA was co-transfected into HepG2 cells with receptor pcDNA3．0-ERαand pRL-TK．Dual-luciferase assay was performed after 48 h treatment by different estrogenic com pounds，including four environmental pollutants 2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether（BDE-47），bisphenol（ABPA），fenvalerate（FEN），perfluorooctanoic acid（PFOA）and three phytoestogens icariin（ICA），daidzein（DAI）and quercetin（QUE），as well as 0．1%DMSO（negative control）and 10 nmol·L－1estradiol（positive control）．RESULTSpGL3-2A6 3EP reporter construct rep resented the strongest concentration-dependent induction response to the estradiol treatment．CYP2A6 transcription activity was significantly up-regulated by all the seven estrogenic compounds．Among these chemicals，BDE-47 was of particular interest with remarkable induction fold changes from 1．45±0．13 to 3．30±0．13（P＜0．01）corresponding to concentrations ranging from 1．0 to 100 nmol·L－1．Phytoestrogens ICA，DAI and QUE represented a similar concentrationinduction pattern．241%to 283%increases compared with DMSO control in CYP2A6 promoter activity were observed under phytoestrogens 10μm ol·L－1treatment．CONCLUSlONCYP2A6 promoter activity is induced by estrogen and estrogenic compounds in an estrogen receptor-dependent manner，implying the biological effects of common environmental endocrine disrupting the chemicals′regulation of CYP2A6 gene transcription in the hum an body．Furthermore，this mechanism can also explore individual nicotine metabolism and carcinogenic susceptibility under hazardous and estrogen-rich environments．

cytochrome P-450 CYP2A6；transcriptional-level control；estrogenic compounds

HE Xiao-yang，E-mail：hexy2008＠szu．edu．cn，Tel：（0755）26538722

R977．1

A

1000-3002（2013）06-0088-09

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（31070731）；and National Natural Science Foundation of China（21271131）

2013-07-16 接受日期：2013-09-25）

國(guó)家自然科學(xué)基金（31070731）；國(guó)家自然科學(xué)基金（21271131）

黃春玲，女，碩士研究生，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究。

何曉陽(yáng)，E-mail：hexy2008＠szu．edu．cn，Tel：（0755）26538722