董 毅，吳利先

（大理學院基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

結核病是全球流行的傳染病之一，該病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb，俗稱結核桿菌）引起的慢性傳染病，可累及全身各器官。全球有1/3的人口感染了結核桿菌〔1〕，該細菌具有潛伏感染的特點。隨著分子生物學的發(fā)展，通過基因分型可了解結核分枝桿菌的流行和感染情況。為初步了解大理地區(qū)結核分枝桿菌的基因分型及流行特征，本研究采用VNTR基因分型技術對大理地區(qū)60株臨床分離結核分枝桿菌菌株進行基因多態(tài)性分析，為結核病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 60株結核分枝桿菌由大理州疾病預防控制中心提供的結核患者的臨床分離株；結核分枝桿菌標準株H37Rv DNA由大理學院基礎醫(yī)學院微生物學與免疫學實驗室保存，作為本次試驗的對照。

1.2 主要試劑 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP購自北京天根生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 超凈工作臺；臺式高速離心機；PCR儀；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)；電泳儀；隔水式恒溫培養(yǎng)箱；超純水機等。

1.4 結核分枝桿菌DNA模板制備 采用常規(guī)Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)4～6周，有菌落生長后，在生物安全柜中取生長良好的結核菌落溶于500 μL TE緩沖液（pH 8.3）中，100℃煮沸30 min，12000 r/min離心5 min，取上清備用，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 VNTR位點的選擇 參考國內(nèi)外文獻和基因數(shù)據(jù)庫〔2-3〕，篩選了3個VNTR位點，引物序列由北京天根生物科技有限公司合成。見表1。實驗中以標準株H37Rv DNA相對分子量為參照標準。

表1 引物序列、重復片斷大小及其在H37Rv中的重復次數(shù)

1.6 VNTR-PCR 采用25 μL PCR反應體系，包括3 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，Taq Mixture（含Taq DNA 聚合酶，dNTP，MgCl2等）12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，分別用3對引物進行擴增。

PCR反應條件：預變性95℃3 min；循環(huán)94℃40 s，77.3℃ 40 s，72℃ 40 s共35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠恒電壓（10 V/cm）電泳，溴化乙錠染色，應用100 bp DNA Ladder作為分子量Marker，標準菌株H37Rv DNA做標準對照。在紫外凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結果，保存圖片。

1.8 結果分析 應用100 bp DNA Ladder作為分子量Marker，采用Quantity one軟件對圖片進行數(shù)字化處理，計算出每個VNTR特異位點的重復次數(shù)，制作Excel表格，再用BioNumerics 6.6軟件進行聚類分析。

2 結果

本實驗研究選取了3個VNTR位點對分離自大理地區(qū)60株結核分枝桿菌進行了基因分型。見圖1～2。

運用軟件BioNmerics 6.6軟件進行聚類分析，采用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arith?metic Mean，非加權組平均法）將大理地區(qū)結核分枝桿菌分為4個基因群（Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群）28個基因型。Ⅰ群占15.0%，含有5個基因型，Ⅱ群占31.7%，含有8個基因型，Ⅲ群占40.0%，含有11個基因型，Ⅳ群占13.3%，含有4個基因型。Ⅲ群所占比例最大，標準菌株也在該群，為大理地區(qū)重點防治的類型。見圖3。

圖1 部分菌株在Qub-11b位點多態(tài)性檢測結果

圖2部分菌株在Qub-4156位點多態(tài)性檢測結果

3 討論

目前國內(nèi)外對結核分枝桿菌分型技術主要分為非核酸法（傳統(tǒng)方法）和核酸法（分子生物方法），DNA指紋技術基因檢測在實驗室污染問題、暴發(fā)流行的調(diào)查、醫(yī)院內(nèi)結核病傳播等方面取得了重大進展，展示了良好的前景〔4〕?，F(xiàn)行的分子生物學方法主要為間隔區(qū)寡核苷酸分型技術（Spoligotyping）、插入序列限制性片段長度多態(tài)性分析（IS6110-RFLP）、VNTR、脈沖場凝膠電泳（PFGE）〔5-9〕等技術。IS6110-RFLP作為結核分枝桿菌基因分型的金標準，但操作復雜，結果分析困難〔10-11〕。

隨著分子生物學的飛速發(fā)展以及結核分子桿菌H37Rv基因組的測定，發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌中存在數(shù)目可變串聯(lián)重復序列（VNTRs）。運用該方法對結核分枝桿菌進行基因分型，操作簡單可靠、重復性好、分辨率接近金標準，正被全球廣泛應用于結核分枝桿菌基因分型和結核分子流行病的研究〔12-13〕。

圖3 60株結核分枝桿菌BioNumerics聚類分析圖

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