高 瑾，王 芳，伍建榕，

(1 西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點實驗室，云南 昆明 650224；2 國家林業(yè)局 西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224)

蘭科是僅次于菊科的第二大科，是被子植物的最大科，全世界約有700屬，近20 000種，主產(chǎn)于熱帶地區(qū)[1]。我國是蘭屬植物分布中心之一,且以地生蘭為主,種質(zhì)資源十分豐富，在中國有171屬，1 247 種，在云南最多，約有100屬、530多種，是世界上蘭花資源最豐富的地區(qū)之一[2]。蘭花大多都生長在濕潤、溫暖、有陽光散射且排水良好的地方，根據(jù)蘭科植物生境的不同可以分為3種：地生蘭、附生蘭和腐生蘭。地生蘭一般生于有礫石和腐殖質(zhì)的沙壤土中，極少數(shù)也可以生于沼澤或濕土上，常見的有蘭屬、兜蘭屬的部分種類等；附生蘭一般生于樹上或巖石縫隙中；腐生蘭通常生長在腐殖質(zhì)和枯枝落葉豐富的地方，一般自身沒有葉綠素，不能進(jìn)行光合作用，只能通過吸收環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)來生存，獲得的營養(yǎng)大部分靠真菌提供[4]。

要探明菌根真菌在蘭花根部的生長狀況及其侵入方式，需要進(jìn)行切片觀察[5]。但就目前的研究進(jìn)展看,關(guān)于蘭科菌根真菌對蘭花組培苗生長影響的研究報道較少,僅見有對墨蘭(Cymbidiumsinense)、建蘭(Cymbidiumensifolium)、卡特蘭(Cattleyasp.)、石斛蘭(Dendrobiumsp.)、春蘭(Cymbidiumgoeringii)、五唇蘭(Doritispulcherrima)等[6]的研究，還未見對兜蘭屬植物菌根的研究報道。蘭科兜蘭屬的蘭花具有較高的觀賞價值，中國是兜蘭屬植物物種最豐富的國家，兜蘭屬為熱帶亞洲屬，主要分布于東南亞至喜馬拉雅山低地再到中國西南部。目前共計有79個野生種記錄在案，其中約1/3產(chǎn)自于中國[7]。杏黃兜蘭特產(chǎn)于我國云南西北部福貢、碧江、瀘水等縣。飄帶兜蘭主產(chǎn)于云南南部，緬甸和泰國也有分布，生于海拔1 200～2 200 m的石灰?guī)r山地林緣樹上或是苔蘚覆蓋的巖石上[8-9]。兜蘭屬植物都被列為一級保護(hù)物種，但大量的人工采挖對其生境造成了破壞，故需對兜蘭屬植物進(jìn)行保護(hù)性研究[10]。春蘭和墨蘭屬于我國國蘭，絕大部分產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，很受國人喜歡，都是很有價值的蘭花種質(zhì)資源[11]。

本試驗選取蘭屬的春蘭、墨蘭及兜蘭屬的飄帶兜蘭和杏黃兜蘭4種地生蘭，對其菌根進(jìn)行石蠟切片，通過光學(xué)顯微鏡觀察蘭花根與真菌共生形成菌根的過程及菌根真菌的侵入途徑，從形態(tài)學(xué)角度分析菌根真菌與蘭科植物的共生關(guān)系，旨在為蘭屬和兜蘭屬植物的保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試野生地生蘭 蘭科植物蘭屬(Cymbidium)的春蘭(C.goeringii)、墨蘭(C.sinense)分別采自云南保山和西雙版納；兜蘭屬(Paphiopedilum)的杏黃兜蘭(P.armeniacum)、飄帶兜蘭(P.parishii)分別采自云南文山和勐臘。

1.1.2 供試菌根真菌 共生真菌菌株CLB113、CLB111分離自野生地生蘭菌根，現(xiàn)保存于西南林業(yè)大學(xué)。

1.2 方 法

1.2.1 無菌組培苗的培育[6，12]將春蘭、墨蘭、飄帶兜蘭和杏黃兜蘭4種地生蘭種子無菌萌發(fā)形成的原球莖，作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，原球莖分化形成完整的蘭花苗，即為無菌組培苗。當(dāng)每株地生蘭苗生長至8～10片葉、株高10～18 cm、根長7～8 cm時，取出待用。

1.2.2 地生蘭與真菌的共生培養(yǎng) 將4種地生蘭無菌組培苗從光照培養(yǎng)箱(25 ℃,2 000 lx)中取出，置于室溫條件下培養(yǎng)1周進(jìn)行練苗，之后取出幼苗，沖洗掉附在根部的瓊脂塊，種植到裝有栽培基質(zhì)的花盆中，同時將感染真菌CLB113、CLB111的麻櫟葉放入根的周圍，與根相距0.5 cm，進(jìn)行共生培養(yǎng)1年。

1.2.3 石蠟切片的制作 取長度3～5 cm 的野生地生蘭顏色泛黃的新鮮根段及其無菌組培苗的根段，以流水沖洗干凈，吸水紙吸干水分，切成 2～4 mm厚的小薄片，迅速放入FAA液中固定48 h，抽氣、梯度脫水、石蠟包埋，再用番紅、固綠染色，旋轉(zhuǎn)連續(xù)切片機切成厚度為8 μm的薄片，中性樹膠封片。15 d后用二甲苯擦去多余的樹膠即可觀察。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲的特點，并記錄拍照(Nikon-E800)[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地生蘭根部結(jié)構(gòu)的比較

觀察發(fā)現(xiàn)，4種野生地生蘭的菌根呈現(xiàn)褐黃色或是灰色，有的根段有乳白色根尖，這是剛生長出的新根，且新根中還沒有菌絲定殖。無菌組培苗的根段為細(xì)長的圓柱形，呈乳白色。鑒于4種野生地生蘭菌根與其無菌組培苗營養(yǎng)根的基本結(jié)構(gòu)相同，故本研究以杏黃兜蘭和春蘭為例進(jìn)行分析。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在杏黃兜蘭和春蘭中，無菌組培苗營養(yǎng)根與菌根的結(jié)構(gòu)相同，從外到內(nèi)分別包括根被、皮層和髓 3部分(圖1～4)，皮層包括外皮層、中皮層和內(nèi)皮層3部分。此外，在墨蘭的皮層組織中，可以觀察到有針狀結(jié)晶(圖5)。針狀結(jié)晶常分布于與外皮層相鄰的幾層皮層細(xì)胞中，研究表明，這些針狀結(jié)晶是植酸鈣鎂，皮層細(xì)胞中的這種結(jié)晶可能也是這類物質(zhì)[15]。

圖1 杏黃兜蘭種子萌發(fā)無菌組培苗營養(yǎng)根的顯微結(jié)構(gòu)

圖3 春蘭種子萌發(fā)無菌組培苗營養(yǎng)根的顯微結(jié)構(gòu)

圖5 墨蘭營養(yǎng)根皮層細(xì)胞中的針狀結(jié)晶

觀察發(fā)現(xiàn)，雖然4種野生地生蘭的根與無菌組培苗營養(yǎng)根的結(jié)構(gòu)基本相似，但在細(xì)胞大小、層數(shù)以及排列上等有差異。4種地生蘭無菌組培苗營養(yǎng)根結(jié)構(gòu)的比較見表1。由表1可知，蘭屬中春蘭和墨蘭無菌組培苗的營養(yǎng)根較粗大，直徑均為4～6 mm，兜蘭屬中杏黃兜蘭和飄帶兜蘭無菌組培苗的營養(yǎng)根較細(xì)，直徑分別為2～4，3～5 mm，這可能與植株大小以及生長環(huán)境有關(guān)。飄帶兜蘭的根被細(xì)胞層數(shù)最多，其次是春蘭和墨蘭，杏黃兜蘭的最少。4種地生蘭無菌組培苗營養(yǎng)根的外皮層、內(nèi)皮層和中皮層細(xì)胞層數(shù)均相同，但中皮層厚度不同，其中飄帶兜蘭中皮層最厚，為220～240 μm，這是因為其細(xì)胞較大；其次是春蘭、墨蘭；杏黃兜蘭的中皮層最薄。這4種地生蘭無菌組培苗營養(yǎng)根均無根毛。

表1 4種地生蘭無菌組培苗營養(yǎng)根結(jié)構(gòu)的比較

2.2 4種地生蘭真菌菌絲的入侵、消解過程

一般真菌侵入蘭科植物根部分為2種方式：一種是菌根真菌破壞根被侵入到皮層細(xì)胞中， 另一種是根被細(xì)胞中存在通道細(xì)胞，菌絲穿過通道細(xì)胞到達(dá)皮層[16-18]。本研究在 4種地生蘭菌根中均觀察了菌絲侵入根部組織的過程，在根被細(xì)胞中未看到通道細(xì)胞，可知菌絲通過破壞根被細(xì)胞到達(dá)皮層組織(圖6)。在菌絲侵入早期階段，其會破壞根被細(xì)胞進(jìn)入皮層細(xì)胞，此時能看到清晰的菌絲形態(tài)，且皮層組織中還無菌絲結(jié)存在；中期階段，可觀察到菌絲圍繞在皮層細(xì)胞核周圍，形成典型的菌絲結(jié)；后期階段，隨著菌絲向內(nèi)皮層移動，已經(jīng)形成的菌絲結(jié)被吸收，菌絲結(jié)消解形成殘片，新定殖的菌絲又形成新的菌絲結(jié)，伴隨新菌絲的生長和侵入,菌根真菌可不斷地為地生蘭的生長提供營養(yǎng),促進(jìn)其快速生長發(fā)育(圖7～9)。

圖6 菌絲破壞根被侵入皮層組織后春蘭菌根結(jié)構(gòu)的顯微觀察

圖7 菌絲侵入皮層組織不同階段的墨蘭菌根顯微觀察

圖8 菌絲侵入皮層組織不同階段的杏黃兜蘭菌根顯微觀察

圖9 菌絲侵入皮層組織不同階段的飄帶兜蘭菌根顯微觀察

2.3 4種地生蘭菌根皮層中菌絲形態(tài)的變化

地生蘭菌根具有典型的蘭科菌根結(jié)構(gòu)，菌絲集中在皮層細(xì)胞的細(xì)胞核周圍，細(xì)胞核膨大形成菌絲結(jié)。菌絲很少存在于皮層細(xì)胞的細(xì)胞間隙中，因此在皮層中未見哈蒂氏網(wǎng)，在根的表面也不能形成菌套。地生蘭菌根真菌是一種內(nèi)生真菌，在地生蘭生長的各個時期，菌根真菌對地生蘭的生長都具有一定的作用。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，在地生蘭根部有3種不同形態(tài)的菌絲，分別為絲狀菌絲、菌絲結(jié)和菌絲結(jié)殘片。絲狀菌絲在真菌剛侵入皮層細(xì)胞時呈現(xiàn)藍(lán)綠色，這些新入侵的絲狀菌絲向皮層細(xì)胞核靠近，為下一步形成菌絲結(jié)做準(zhǔn)備。新入侵的絲狀菌絲纏繞在皮層細(xì)胞核周圍，細(xì)胞核膨大成團(tuán)狀，形成了棕紅色或咖啡色菌絲結(jié)。菌絲結(jié)形成之后，細(xì)胞便會分泌化學(xué)物質(zhì)將其包圍、消解，在皮層細(xì)胞中能清晰地觀察到被消解后的菌絲結(jié)殘片(圖7～9)。而在相應(yīng)的無菌組培苗營養(yǎng)根中未觀察到真菌入侵的跡象，在皮層部位也無菌絲結(jié)。有時在地生蘭菌根同一皮層組織的不同部位可同時觀察到3種不同形態(tài)的菌絲存在，隨采樣季節(jié)不同，可觀察到菌絲的形態(tài)不同，由此推斷，在真菌與地生蘭的共生過程中，3個階段是連續(xù)進(jìn)行的，相鄰細(xì)胞之間雖然不是完全同步，但相互之間不會產(chǎn)生影響。

通過對4種地生蘭不同季節(jié)菌根內(nèi)菌絲狀態(tài)及數(shù)量比較，可知菌絲結(jié)和菌絲殘片在菌根中所占的比例因季節(jié)的不同而有所差異。春蘭的花期為1-3月，墨蘭為10月-翌年3月，杏黃兜蘭為2-4月，飄帶兜蘭為6-7月，切片觀察發(fā)現(xiàn)，在花期以及花期前后4種地生蘭菌絲結(jié)和菌絲結(jié)殘片較多，而在生長季節(jié)絲狀菌絲較多(表2)。

表2 4種地生蘭不同季節(jié)菌根內(nèi)菌絲的組成

3 結(jié)論與討論

蘭科植物(Orchidaceae)是典型的菌根(mycorrhizal)植物，不僅在種子萌發(fā)階段與真菌有著密不可分的聯(lián)系，在幼苗和成年期仍需要真菌為其提供營養(yǎng)。蘭科植物菌根真菌入侵根部有2個時期，第一個時期是在種子萌發(fā)時，真菌穿過胚根的細(xì)胞壁，侵入細(xì)胞進(jìn)行生長，此時可以為種子的萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)；第二個時期是在胚芽形成幼根之后，菌根真菌侵入根部皮層細(xì)胞。天麻是蘭科植物的代表種。徐錦堂等[19]從天麻根中分離到紫萁小菇(Mycenaosmundicola)和蜜環(huán)菌(Armiuariamellea),結(jié)果表明,天麻種子可與紫萁小菇共生萌發(fā)形成原球莖。形成原球莖之后，就需要蜜環(huán)菌的侵入。說明蘭科植物在生長的不同時期，需要不同的真菌與其共生。菌根真菌侵入皮層細(xì)胞有2種方式，一種是在根被細(xì)胞中存在通道細(xì)胞時，菌根真菌通過根被細(xì)胞中的通道細(xì)胞進(jìn)入，根被中的通道細(xì)胞為活細(xì)胞，壁薄，具細(xì)胞核，其他細(xì)胞通常是密集的厚壁死細(xì)胞；另一種是在根被中不存在通道細(xì)胞時，菌根真菌通過直接破壞根被細(xì)胞進(jìn)入皮層細(xì)胞[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，地生蘭與菌根真菌共生時,菌根真菌破壞根被侵入其皮層細(xì)胞內(nèi),在皮層細(xì)胞核周圍形成菌絲結(jié)，菌絲結(jié)被消解吸收之后，周圍的菌絲會繼續(xù)形成新的菌絲結(jié)。伴隨新菌絲的生長和侵入,菌根真菌可不斷地為地生蘭提供營養(yǎng)物質(zhì),促進(jìn)其快速生長發(fā)育。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，成年的野生地生蘭根細(xì)胞內(nèi)包含2種菌絲，一種是菌絲團(tuán)狀的，菌根真菌侵入地生蘭的營養(yǎng)根后，在皮層細(xì)胞內(nèi)形成螺旋狀的菌絲結(jié)或是不規(guī)則形狀的菌絲附屬物，這種菌絲團(tuán)壽命不長，幾天之內(nèi)就會逐漸被皮層細(xì)胞消解吸收；另一種是非菌絲團(tuán)狀的，這種菌絲會在先前的菌絲團(tuán)被消解之后重新定殖形成新的菌絲團(tuán)，這個過程不斷重復(fù)。

本研究通過4種地生蘭根部結(jié)構(gòu)的顯微切片，觀察到了菌根真菌菌絲在地生蘭根部皮層組織中的定殖及消解過程，但地生蘭的皮層組織細(xì)胞分泌了何種物質(zhì)及如何將菌絲結(jié)消解吸收，還有待進(jìn)一步研究。此外，關(guān)于地生蘭與菌根真菌的共生關(guān)系，到底是偏利共生還是互利共生，也有待從營養(yǎng)物質(zhì)流向以及生長狀態(tài)等方面進(jìn)行深入研究。通過對4種地生蘭不同季節(jié)菌根內(nèi)菌絲狀態(tài)及數(shù)量的比較發(fā)現(xiàn)，菌絲結(jié)和菌絲殘片在菌根中所占的比例依季節(jié)的不同而有所不同。關(guān)于菌絲的形態(tài)在花期及生長期不同的原因還有待進(jìn)一步研究。

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