梁亞芳， 苗 亮， 李明云， 趙 亮， 李笑萌， 徐玉敏， 陳 炯

(寧波大學 海洋學院， 浙江 寧波 315211)

近年來，隨著排入海洋的陸源污染物總量不斷增加，重金屬污染日趨嚴重[1-2]。對海洋環(huán)境重金屬離子進行快速有效地檢測已成為環(huán)境控制和治理中的重要內容。大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)為暖水性潮間帶魚類，在中國東南沿海分布廣泛，其食物鏈短、存活力強，研究顯示大彈涂魚的多項生理指標對環(huán)境污染物敏感[3-5]。

彗星實驗(Comet assay)又稱單細胞凝膠電泳實驗(Single cell gel electrophoresis)，是一種通過檢測DNA鏈損傷判別遺傳毒性的技術[6-7]。該技術已在檢測環(huán)境污染物對生物的遺傳毒性方面已有較多研究報道[8-10]。

本研究采用單細胞凝膠電泳檢測重金屬Pb、Cr對大彈涂魚外周血細胞的遺傳損傷情況，探討以DNA損傷作為污染暴露生物標記的可行性，同時為重金屬脅迫的血液毒理學以及評估鉛、鉻對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

實驗用野生大彈涂魚捕自浙江省寧波市鎮(zhèn)海區(qū)澥浦沿海灘涂，體長(10.8±1.2) cm，體重(8.4±2.4) g，在實驗室暫養(yǎng)7 d后，選取活潑、無病、表皮無損傷的個體進行試驗。

實驗用醋酸鉛、重鉻酸鈉及其他試劑均購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 單細胞凝膠電泳方法

用肝素鈉處理過的注射器從大彈涂魚尾部動脈取血，每次取樣10尾，用PBS稀釋至106個細胞/mL。

Pb、Cr溶液分別用醋酸鉛、重鉻酸鈉配制，以國家漁業(yè)水質標準GB11607-89(鉛≦0.005 mg/L，鉻≦0.05 mg/L)規(guī)定的2種離子最高濃度為標準濃度，每種離子均設置4個濃度梯度：標準濃度組、低濃度組(標準濃度的10倍)、中濃度組(標準濃度的100倍)和高濃度組(標準濃度的1000倍)。另設置空白對照組(2種離子濃度均為0)。每組實驗均設置3個重復。外周血細胞于25℃染毒1 h后，2000 r/min離心5 min收集血細胞。

參照Singh等[7]的方法進行單細胞凝聚電泳，略加改進。采用3層鋪膠法在32×24 mm的蓋玻片上鋪膠，低熔點瓊脂糖和正常熔點的瓊脂糖在鋪膠后的最終濃度保持在0.5%。第一層在預熱的洗液漂洗過的磨砂載玻片上，滴加100 μL 45℃正常熔點的瓊脂糖，蓋上蓋玻片，4℃冰箱中冷凝10 min。揭去蓋玻片加35℃ 0.5%的混有血細胞低熔點瓊脂糖85 μL，4℃冰箱中冷凝10 min；最后加90 μL的低熔點瓊脂糖。4℃下，在高鹽裂解液(NaCl 2.5 mol/L，EDTANa2100 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L，1%十二烷基肌氨酸鈉，臨用前加Trition X-100終濃度為1%，二甲亞砜終濃度為10%)中裂解2 h。裂解后用PBS漂洗3次后放入堿性電泳緩沖液中(EDTANa21 mmol/L，NaOH 300 mmol/L)解旋40 min。電泳工作電流為200 mA，電泳時間45 min。電泳結束后用pH值7.5的0.4 mol/L的Tris-HCl緩沖液中和15 min后用20 μg/mL的吖啶橙染色15 min，在熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE 80I)下觀察、拍照，根據CASP軟件獲取的彗星數據計算每個彗星的彗尾長度(Tail Length，TL)、彗尾DNA相對含量(Tail DNA relative%，TD)、尾動量(Tail Moment，TM)和Olive尾動量(Olive Tail Moment，OTm)。用SPSS 13.0軟件分析每種離子不同組間的各項數據并進行One-way ANOVA檢測，以P<0.05為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 國標濃度的鉛、鉻對大彈涂魚血細胞遺傳損傷的影響

由圖1可見，空白對照組、Pb國標濃度脅迫組和Cr國標濃度脅迫組的大彈涂魚血細胞經單細胞凝膠電泳后均呈較規(guī)則的圓形，未出現明顯的彗星拖尾。與空白對照組相比，Pb國標濃度脅迫組和Cr國標濃度脅迫組在TL、TD、TM、OTM 4項上均無顯著性差異(P>0.05)，見表1，表明國標濃度的Pb和Cr均不會引起大彈涂魚血細胞遺傳損傷。

圖1 國標濃度的Pb、Cr脅迫后大彈涂魚血細胞彗星圖譜

a—空白對照組； b—Pb脅迫組(0.005 mg/L)； c—Cr脅迫組(0.05 mg/L)。

表1 國標濃度的Pb、Cr脅迫后大彈涂魚血細胞DNA彗星實驗結果

注：表中數據是依據圖片像素和光密度表示DNA損失程度的彗星測量數據，計算方法詳見CASP軟件說明；同一列各行中字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 Pb脅迫對大彈涂魚血細胞的遺傳損傷

單細胞凝膠電泳結果顯示，經國標10倍、100倍和1000倍濃度的Pb脅迫后，大彈涂魚血細胞均出現了明顯的彗星拖尾，且隨著Pb濃度升高，彗尾長度增加、熒光強度增大(圖2)表明細胞DNA受損。CASP軟件測量結果顯示(表2)，彗星的拖尾長度、尾部DNA百分比和尾動量3個指標均隨著Pb濃度的升高而顯著增大(P<0.05)；低濃度組和中濃度組的Olive尾動量均分別顯著大于國標組和低濃度組(P<0.05)，而高濃度組的Olive尾動量雖高于中濃度組但差異不顯著(P>0.05)?？梢姼哂趪鴺藵舛鹊腜b對大彈涂魚血細胞有明顯的遺傳損傷，且損傷程度與Pb濃度之間存在“劑量-效應”關系。

圖2 不同濃度的Pb脅迫后大彈涂魚血細胞彗星圖像

a—低濃度組(0.05 mg/L)； b—中濃度組(0.5 mg/L)； c—高濃度組(5 mg/L)。

表2 不同濃度的Pb脅迫后大彈涂魚血細胞DNA彗星實驗結果

2.3 Cr脅迫對大彈涂魚血細胞的遺傳損傷

彗星實驗結果顯示，大彈涂魚血細胞在受到國標10倍、100倍和1000倍濃度的Cr脅迫后均出現了明顯的彗星拖尾，且彗尾的長度和熒光強度均隨Cr濃度升高而增加(圖3)，表明細胞DNA受損。經CASP軟件測量(表3)，各個濃度組的彗星拖尾長度、尾部DNA百分比、尾動量和Olive尾動量等4個指標均隨著Cr濃度的升高而顯著增大(P<0.05)；低濃度組和中濃度組的Olive尾動量均分別顯著大于國標組和低濃度組(P<0.05)，表明高于國標濃度的Cr對大彈涂魚血細胞有明顯的遺傳損傷，且損傷程度與Cr濃度之間存在“劑量-效應”關系。

圖3 不同濃度的Cr脅迫后大彈涂魚血細胞彗星圖像

a—低濃度組(0.5 mg/L)； b—中濃度組(5 mg/L)； c—高濃度組(50 mg/L)。

3 討論

重金屬是非降解的元素型環(huán)境污染物，可引發(fā)生態(tài)系統(tǒng)破壞，進入水體后會對生物產生顯著的毒性作用，并且重金屬可在生物體內富集，對生物具有致畸、致癌、致死的作用[11]。國內外學者已在重金屬元素引起的海洋污染以及對海洋生物的毒理效應和致毒機制等方面進行了大量的研究[12-16]。

表3 不同濃度的Cr脅迫后大彈涂魚血細胞DNA彗星實驗結果

Pb和Cr都是常見的環(huán)境重金屬污染物，其中Pb是人體非必需元素，為抑制積累性毒物，可通過食物鏈傳遞[17-18]。Pb會損害生物的造血功能，誘發(fā)神經系統(tǒng)功能紊亂[19-20]，并會干擾DNA代謝(如DNA斷裂、甲基化異常等)，造成遺傳損傷[20-25]。Cr是一種人類必需元素，在肌體的糖代謝和脂代謝中發(fā)揮特殊作用[26]，但高濃度的Cr也會對細胞和生物體產生毒害作用[27-29]。

目前關于Pb和Cr對魚類的影響已有較多研究報導，如溫茹淑等[29]的研究顯示Pb對草魚魚苗的24、48、72和96 h半致死濃度分別為0.431、0.338、0.375和0.362 mg/L；雷忻等[30]的研究顯示Cr對金魚的24、48、72和96 h半致死濃度分別為387.1、370.9、281.9和200.2 mg/L，并可造成鰓組織的嚴重損傷。本研究通過彗星實驗檢測了Pb和Cr對大彈涂魚外周血細胞的遺傳損傷，結果顯示重金屬濃度和DNA損傷程度間存在著明顯的“劑量-效應”關系，金春華等[5]的研究也顯示大彈涂魚血細胞DNA損傷程度與鎘離子濃度間存在“劑量-效應”關系，因此大彈涂魚外周血細胞的DNA損傷可以作為一種污染暴露的生物標記。

唐建勛等[10]的研究顯示Pb可引起泥鰍卵細胞凋亡和DNA損傷，且存在“劑量-效應”關系，但無“時間-效應”關系；金春華等[5]的研究顯示鎘對大彈涂魚血細胞的DNA損傷既有“劑量-效應”關系又有“時間-效應”關系。本研究結果顯示Pb和Cr濃度與大彈涂魚血細胞DNA損傷程度間均存在明顯的“劑量-效應”關系，而是否存在“時間-效應”關系尚需進一步研究。另外，研究顯示不同的重金屬離子間存在協(xié)同作用或拮抗作用[31]，Pb和Cr之間是否有協(xié)同作用或拮抗作用有待于進一步研究。

本研究通過彗星實驗顯示重金屬鉛和鉻都會引起大彈涂魚血細胞DNA的損傷，但尚不清楚這兩種重金屬引起遺傳損傷的機制以及機體是否能通過激活自身的DNA修復系統(tǒng)進行損傷修復。在今后的研究中，將一方面通過H2AX焦點和磷酸化水平[32-33]檢測鉛、鉻脅迫后大彈涂魚細胞DNA損傷、修復情況，另一方面通過蛋白質組、轉錄組研究探討其遺傳損傷機制[34]，以豐富重金屬鉛、鉻的環(huán)境毒理學研究資料。

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