杜 樂 周 艷 林艷云 柏強(qiáng)善 張 彬 安廣洲 苗 霞 丁桂榮 郭國(guó)禎(中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)教研室 西安 7003)
2(中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員旅 西安 710032)
隨著無線通訊事業(yè)的飛速發(fā)展和移動(dòng)電話在全世界范圍內(nèi)的普及,射頻輻射對(duì)人類健康的影響已經(jīng)成為生物電磁學(xué)和環(huán)境醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[1-3]。研究表明,睪丸是電磁輻射的敏感靶器官之一。一定參數(shù)的射頻輻射可以引起睪丸結(jié)構(gòu)和功能的損傷,造成性功能和生育能力下降[4]。
支持細(xì)胞(Sertoli 細(xì)胞)是位于生精上皮的壁細(xì)胞,該細(xì)胞位于管壁基底膜并延伸至曲細(xì)精管管腔,沿著支持細(xì)胞胞體,精原細(xì)胞發(fā)育至成熟精子的所有形態(tài)、生理變化過程都在此發(fā)生。作為與生精細(xì)胞接觸的惟一體細(xì)胞,支持細(xì)胞在生精過程中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用[5]。其主要作用是在精子生成過程中,Sertoli細(xì)胞為精子發(fā)生提供物理支撐和穩(wěn)定的微環(huán)境,并為精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和發(fā)育所需的細(xì)胞因子[6]。研究表明,支持細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子,其中研究較多的是干細(xì)胞因子(SCF)和膠質(zhì)細(xì)胞系來源的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(GDNF)。據(jù)報(bào)道,SCF和GDNF能夠促進(jìn)精原干細(xì)胞的增殖與分化[7-11]。
本研究以建系的小鼠睪丸支持細(xì)胞(TM4)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行連續(xù)5 d的1950 MHz GSM信號(hào)輻照,探討該條件下射頻輻射對(duì)TM4細(xì)胞增殖和分泌功能的影響,為明確射頻輻射對(duì)人類生殖健康的影響提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
HERAcell 240i 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo),DMEM/F12 1:1(Thermo),胎牛血清(杭州四季青),T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Nunc),96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nest),電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械廠),CCK-8(碧云天),Model680 酶標(biāo)儀(Bio-Rad),BrdU試劑盒(merk),兔抗小鼠Ki67抗體(Abcam),山羊抗兔熒光二抗(博士德),熒光倒置顯微鏡(Leica),ELISA試劑盒(Bio-Swamp),美國(guó)Bection Dickinson公司流式細(xì)胞儀(BD FACSAria),光學(xué)顯微鏡(Olympus),臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Zentrifugen),超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)。
TM4細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室的張遠(yuǎn)強(qiáng)教授惠贈(zèng)。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM/F12 1:1(含10%胎牛血清、100 μg·mL?1青霉素、100 μg·mL?1鏈霉素、2.50 mmol·L?1谷氨酰胺和15 mmol·L?1HEPES),每2 d換液一次。當(dāng)細(xì)胞密度為80%?90%時(shí),用胰酶消化傳代。
輻照系統(tǒng)(sXc-1950 MHz)購(gòu)自瑞士IT’IS公司,主要包括4部分:一個(gè)射頻輻射發(fā)生器,一個(gè)專制的功能發(fā)生器,一個(gè)狹窄的帶狀放大器和兩個(gè)矩形的波導(dǎo)腔。每個(gè)波導(dǎo)腔可放置6個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿(直徑35 mm),一個(gè)波導(dǎo)腔產(chǎn)生射頻電磁場(chǎng),用于細(xì)胞輻照;另一個(gè)波導(dǎo)腔不產(chǎn)生射頻電磁場(chǎng),用于細(xì)胞假輻照。通過計(jì)算機(jī)隨機(jī)選擇輻照組和假輻照組,并對(duì)整個(gè)細(xì)胞暴露系統(tǒng)進(jìn)行比吸收率(0?4.0 W·kg?1)定量和全反饋控制。該系統(tǒng)以1950 MHz頻率穩(wěn)定運(yùn)轉(zhuǎn)。整個(gè)輻照過程中,細(xì)胞處于(37±0.1) ℃、5%CO2的環(huán)境中。輻照組和假輻照組溫度差控制在0.1 ℃以內(nèi)。
將TM4細(xì)胞制備成1.5×103個(gè)·mL?1的細(xì)胞懸液,接種于35 mm培養(yǎng)皿,每皿接種3 mL。細(xì)胞接種后24 h,更換新鮮培養(yǎng)液,并將其隨機(jī)分為2組,分別置于輻照裝置的兩個(gè)小室中:一個(gè)小室產(chǎn)生GSM信號(hào),用于細(xì)胞輻照;另一個(gè)小室不產(chǎn)生GSM信號(hào),用于假輻照。輻照參數(shù)為:GSM-Talk信號(hào),1950 MHz連續(xù)波,比吸收率為3 W·kg?1,輻照時(shí)間為5 d。
TM4細(xì)胞輻照結(jié)束后,細(xì)胞用 0.25%胰酶消化為單細(xì)胞懸液,離心(800 r·min?1, 5 min),收集細(xì)胞沉淀,用含10%血清的DMEM/F12 1:1 培養(yǎng)液重懸,制成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至1×104個(gè)·mL?1。用移液器吸取100 μL稀釋后的細(xì)胞懸液接種到96 孔板上,每組8個(gè)復(fù)孔,總共接種5塊96孔板,分別檢測(cè)細(xì)胞輻照后1?5 d的增殖情況。將接種后的96孔板置于37 ℃、5%CO2孵箱中,于培養(yǎng)24 h后,取一塊96孔板,每孔加入10 μL CCK-8溶液,低速震蕩10 min,37 ℃孵育4 h后,在酶標(biāo)儀上,選擇450 nm波長(zhǎng),測(cè)定各孔吸光度值(OD值)。后面4 d的加試劑時(shí)間,試劑量,測(cè)定方法同第1 d。計(jì)算每組OD值,算術(shù)平均數(shù)繪制折線圖。
按照BrdU試劑盒說明進(jìn)行操作。根據(jù)CCK-8檢測(cè)結(jié)果,選取輻照后1 d和3 d的細(xì)胞(輻照組和假輻照組)進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞輻照后增殖情況,在輻照后1 d,每組取兩個(gè)皿,0.25%胰酶消化為單細(xì)胞懸液,離心(800 r·min?1, 5 min),收集細(xì)胞沉淀,用含10%血清的DMEM/F12 1:1 培養(yǎng)液重懸,制成單細(xì)胞懸液后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)·mL?1,每組接種100 μL于96孔板中,每組設(shè)3個(gè)樣品復(fù)孔,1個(gè)空白對(duì)照和1個(gè)背景孔。空白對(duì)照孔只加100 μL培養(yǎng)液(不加細(xì)胞懸液),背景孔只加100 μL細(xì)胞懸液(不加BrdU標(biāo)記物)。在每個(gè)樣品孔中加20 μL BrdU工作貯存液。在孵箱中溫育2?24 h。去除孔中內(nèi)容物:將96孔板顛倒并用紙巾輕輕將殘液除去。在每孔中加200 μL固定液。室溫下溫育30 min。去除孔中內(nèi)容物:將96孔板顛倒,在紙巾上扣擊板將殘液除去。然后將板置于4 ℃條件下1周。用抗體稀釋液將100×抗BrdU抗體稀釋100倍,在每孔中加100 μL稀釋后的溶液,室溫下溫育1 h。在每孔中加滿1×洗劑液洗3次。在紙巾上輕輕去除殘液。在每孔加 100 μL共軛稀釋液,室溫下溫育30 min。洗劑同前。在所有板孔中加滿dH2O,將96孔板顛倒,在紙巾上扣擊板將殘液除去。在每孔中加100 μL底物溶液,室溫避光溫育15 min。在每孔中加100 μL終止液,加樣順序同加底物順序。用分光光度計(jì)在雙波長(zhǎng)450?540 nm(或450?595 nm)下測(cè)定每孔的吸光度(OD值)。每組OD值=樣品孔的平均OD值?空白孔OD值?背景孔OD值。
輻照后,將細(xì)胞接種于12孔板內(nèi)的無菌蓋玻片上,接種量為800個(gè)細(xì)胞/孔,在輻照后第3 d,此時(shí)每孔的細(xì)胞量大約為50%?60%,用多聚甲醛室溫固定30 min;PBS洗3次,每次5 min;0.15%TritonX-100室溫透化10?15 min;PBS洗3次,每次5 min ;5%山羊血清室溫封閉15?20 min;PBS洗3次,每次5 min ;加一抗:兔抗小鼠Ki67(用PBS稀釋Ki67,稀釋比為1: 50),放入濕玻璃皿中4 ℃孵育過夜。取出濕玻璃皿至常溫復(fù)溫0.5 h,PBS洗3次,每次5 min;常溫、避光條件下孵育二抗:山羊抗兔488(用PBS稀釋二抗,稀釋比為1:500)1 h;PBS洗3次,每次5 min;常溫避光條件下孵育DAPI(用PBS稀釋DAPI,稀釋比為1:20) 5 min;PBS洗2次,每次5 min;在熒光顯微鏡下觀察和拍攝圖片。
輻照結(jié)束后,收取1?5 d的細(xì)胞上清,檢測(cè)TM4細(xì)胞輻照后1?5 d分泌SCF(或GDNF)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:準(zhǔn)備小試管6只,依次編好號(hào)碼,先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100 μL,然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100 μL加入一只已編好號(hào)的試管中,充分混勻;再在該試管中取100 μL加入第二支試管中,充分混勻;再在該試管中取100 μL加入第三只試管中,充分混勻;再在該試管中取100 μL加入第四只試管中,充分混勻;再在該試管中取100 μL加入第五只試管中,充分混勻;然后在該試管中取100 μL,棄掉。第六只試管作為0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后各管濃度分別為2400、1200、600、300、150 和0 pg·mL?1。在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔,依次加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL(每個(gè)濃度做2個(gè)復(fù)孔)。加樣:分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品、酶標(biāo)試劑及生物素標(biāo)記的抗SCF(或GDNF)抗體,其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品40 μL,然后再加生物素標(biāo)記的抗SCF(或GDNF)抗體10 μL。加樣:將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。溫育:用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL,空白孔除外。溫育:操作同前。洗滌:操作同前。顯色:每孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min。終止:每孔加終止液50 μL,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。測(cè)定:以空白孔調(diào)零,在450 nm波長(zhǎng)處,依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算TM4細(xì)胞(樣品孔)分泌SCF(或GDNF)的濃度。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包分析,樣本描述用±s表示,兩組間樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),p<0.05或p<0.01時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與假輻照組相比,GSM-Talk信號(hào)連續(xù)輻照細(xì)胞5 d后, TM4細(xì)胞增殖在輻照后2?5 d受到明顯抑制,具體見圖1。
圖1 輻照后不同時(shí)間TM4細(xì)胞增殖情況**, p<0.01, 與假輻照組相比Fig.1 TM4 cell proliferation at different time points after radiation(**, p<0.01, vs.control group)
BrdU檢測(cè)結(jié)果表明,TM4細(xì)胞連續(xù)暴露于GSM-Talk信號(hào)5 d后,細(xì)胞增殖受到抑制,輻照后3 d兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),見圖2。
圖2 輻照后第1 天和第3 天TM4細(xì)胞增殖情況Fig.2 TM4 cell proliferation at 1 d and 3 d after radiation
射頻輻照后第3 d,免疫熒光結(jié)果顯示,輻照組TM4細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67的表達(dá)較對(duì)照組減弱,見圖3和圖4。
圖3 輻照后第3 d TM4細(xì)胞Ki67免疫熒光染色結(jié)果 (×200)Fig.3 Ki67 immunofluorescence staining results at 3 d after TM4 cell radiation (×200)
圖4 輻照后第3 天TM4細(xì)胞Ki67熒光強(qiáng)度結(jié)果Fig.4 Ki67 fluorescence intensity results at 3 d after TM4 cell radiation
TM4細(xì)胞輻照后2?5 d,細(xì)胞上清中SCF濃度明顯低于假輻照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),輻照后第1 d和第3 d,輻照組細(xì)胞上清中GDNF的濃度明顯高于假輻照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),見圖5和圖6, 提示該條件下的射頻輻射可影響TM4細(xì)胞的分泌功能。
圖5 輻照后不同時(shí)間TM4細(xì)胞上清中SCF濃度變化Fig.5 The concentration of SCF in TM4 cell supernatant at different time points after radiation
圖6 輻照后不同時(shí)間TM4細(xì)胞上清中GDNF濃度變化Fig.6 The concentration of GDNF in TM4 cell supernatant at different time points after radiation
睪丸支持細(xì)胞是生精上皮的支持結(jié)構(gòu),貫穿生精上皮的全層。研究表明,支持細(xì)胞在精子發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道,一定參數(shù)的射頻電磁輻射能夠影響睪丸支持細(xì)胞的增殖和細(xì)胞結(jié)構(gòu)等。高曉芳等[12]將體外培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞暴露于功率密度分別為0、30和100 mW·cm?2的微波輻射中各5 min,結(jié)果顯示,輻照后支持細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制,表現(xiàn)為G0-G1期細(xì)胞數(shù)量增加,G2-M和S期細(xì)胞數(shù)量減少,凋亡和死亡細(xì)胞增加,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加。作者認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加是微波誘導(dǎo)支持細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。吳惠等[13]為探討不同波段電磁輻射對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞損傷效應(yīng)的異同,將原代培養(yǎng)的Sertoli細(xì)胞經(jīng)場(chǎng)強(qiáng) 6×104V·m?1的電磁脈沖(Electromagnetic pulse, EMP),平均功率密度為100 mW·cm?2的S-波段高功率微波(S-band high power microwave, S-HPM)和X-波段高功率微波輻射( X-band high power microwave, X-HPM),結(jié)果顯示,3種波段電磁輻射后,Sertoli細(xì)胞的晚期凋亡和壞死率增加;細(xì)胞代謝活性降低,且超寬譜波段的EMP致Sertoli細(xì)胞的損傷最明顯。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1950 MHz GSM-Talk信號(hào)連續(xù)輻照TM4細(xì)胞5 d后, TM4細(xì)胞增殖受到明顯抑制,CCK-8、BrdU和Ki67免疫熒光檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)了這一現(xiàn)象,該結(jié)果與高曉芳等的報(bào)道結(jié)果一致。此外,還有學(xué)者研究了射頻輻射對(duì)睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的影響。Serkan ?elik等[14]將雄性Wistar-Kyoto大鼠暴露于SAR為1.58 W·kg?1的手機(jī)輻射中3個(gè)月后,透射顯微鏡下觀察睪丸的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)輻照組睪丸支持細(xì)胞胞漿有空泡和高電子密度結(jié)構(gòu)形成以及大量脂滴存在,提示手機(jī)輻射可能引起支持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。吳惠等[13]研究表明三種不同波段的電磁輻射可致原代培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞胞漿顆粒增多且空泡變性;超微結(jié)構(gòu)主要為線粒體腫脹、空化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。本科室前期研究表明[15]2450 MHz微波局部照射BALB/c小鼠睪丸后,各級(jí)生精細(xì)胞出現(xiàn)以濁腫為主的病理學(xué)改變,支持細(xì)胞病變的特異表現(xiàn)為萎縮變性,出現(xiàn)細(xì)胞體積明顯縮小,如突起回縮,由直立位變?yōu)闄M臥位,或成為緊靠基膜的薄層部分,染色加深。
研究表明,射頻輻射除對(duì)睪丸支持細(xì)胞的增殖和細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成影響外,還可導(dǎo)致細(xì)胞(包括睪丸支持細(xì)胞)分泌功能的改變[16-18]。支持細(xì)胞是唯一與生精細(xì)胞接觸的體細(xì)胞,在精子發(fā)生過程中,支持細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞自我更新和分化,精母細(xì)胞減數(shù)分裂以及圓形精子細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精子[19]。其中研究較多的細(xì)胞因子是SCF和GDNF。SCF又稱c-kit配體,肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子(MGF)。研究表明,SCF能夠促進(jìn)小鼠精原細(xì)胞分化為圓形精子細(xì)胞[20],而且可誘導(dǎo)小鼠A1-A4型精原細(xì)胞的增殖和分化[21]。GDNF是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的一個(gè)相關(guān)成員。它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體復(fù)合物包括酪氨酸激酶 Ret 受體和 GDNF 家族受體α1。據(jù)報(bào)道,GDNF可促進(jìn)未分化型精原細(xì)胞(包括精原干細(xì)胞)的增殖[22-23]。本實(shí)驗(yàn),我們對(duì)射頻輻照后支持細(xì)胞上清中的SCF和GDNF水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示,1950 MHz GSM-Talk信號(hào)連續(xù)輻照5 d后的第2 d到第5 d,細(xì)胞上清中SCF濃度明顯降低,輻照后第1 d和第3 d,細(xì)胞上清中GDNF濃度顯著增加。除探討電磁輻射引起Sertoli細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu),增殖和分泌功能改變外,電磁輻射致Sertoli細(xì)胞的損傷會(huì)對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生何種影響呢?研究表明[24],Sertoli細(xì)胞經(jīng)γ射線照射后,細(xì)胞因子IL6的表達(dá)增強(qiáng)。Wu等[16]將睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行微波輻照后,發(fā)現(xiàn)其分泌因子:腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)增加,這些上調(diào)的分泌因子能夠誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的凋亡和生殖細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化。作者推測(cè),射頻輻照后SCF和GDNF這兩種細(xì)胞因子水平的改變也將對(duì)精子的正常發(fā)生產(chǎn)生影響。
截止目前,關(guān)于射頻輻射對(duì)睪丸支持細(xì)胞分泌因子GDNF、SCF表達(dá)的影響研究尚未見報(bào)道,僅檢索到一些關(guān)于電離輻射對(duì)睪丸支持細(xì)胞分泌功能影響的研究文獻(xiàn)。Mauduit等[25]報(bào)道,成年雄性小鼠接受X線(4 Gy)照射72 h后,支持細(xì)胞中SCF的表達(dá)未見明顯改變。Albuquerque等[26]將成年雄性小鼠用6 Gy γ60Co射線照射,發(fā)現(xiàn)輻照后支持細(xì)胞數(shù)量、結(jié)構(gòu)及分泌SCF和GDNF的能力沒有改變。提示,不同性質(zhì)的物理因子對(duì)睪丸支持細(xì)胞分泌功能的影響也存在差異。其主要原因可能與各研究機(jī)構(gòu)之間使用的射頻輻射源的種類,實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同有關(guān)。
本研究首次報(bào)道了1950 MHz GSM-Talk信號(hào)對(duì)睪丸支持細(xì)胞增殖及分泌功能的影響,結(jié)果提示,1950 MHz GSM-Talk信號(hào)連續(xù)輻照5 d可抑制TM4細(xì)胞的增殖并影響其分泌功能。睪丸支持細(xì)胞對(duì)精子正常發(fā)生起著至關(guān)重要的作用,射頻輻射致睪丸支持細(xì)胞的效應(yīng)可能影響精子的正常發(fā)生,最終導(dǎo)致生殖功能異常。本研究為正確評(píng)估手機(jī)射頻輻射對(duì)生殖健康的影響及衛(wèi)生防護(hù)提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)于射頻輻射影響支持細(xì)胞增殖及分泌功能的分子機(jī)制,有待進(jìn)一步研究。
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