劉 超，朱彥卓，代文俊，任燕萍

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052）

棉花作為我國主要的經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有很重要的地位。隨著人們生活水平的不斷提高，對棉產(chǎn)品的需求也日趨增加。利用現(xiàn)代分子育種技術(shù)提高棉花抗逆性是解決棉花抗逆育種的有效途徑。雖然轉(zhuǎn)基因棉花技術(shù)在我國研究起步較晚，但已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展。國內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)基因棉花的研究以往多側(cè)重于抗旱棉以及轉(zhuǎn)Bt基因的抗蟲棉等方面，對其它基因的報(bào)道相對較少。現(xiàn)將轉(zhuǎn)基因棉花抗逆性研究進(jìn)展綜述如下。

1 轉(zhuǎn)基因棉花的抗旱性

隨著全球溫室效應(yīng)的不斷加劇，干旱問題日益突出，嚴(yán)重影響了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。在我國西北地區(qū)，水資源缺乏的問題更為明顯。因此，研究抗旱的轉(zhuǎn)基因棉花對提高棉花產(chǎn)量和減少灌溉次數(shù)有重大意義。

呂素蓮[1]的研究表明，轉(zhuǎn)betA基因的棉花的抗早性顯著增強(qiáng)，不僅是因?yàn)樘鸩藟A在干旱條件下保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性，而且積累的甜菜堿可使轉(zhuǎn)基因棉花的滲透調(diào)節(jié)能力得到提高。更有意義的是，在盛花期經(jīng)過干早處理后，4號轉(zhuǎn)基因株系的單株產(chǎn)量顯著高于對照植株。

轉(zhuǎn)基因棉花蕾期抗旱性驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，過量表達(dá)TsVP基因提高了轉(zhuǎn)基因棉花干旱處理下蕾期的適應(yīng)能力。在干旱處理后，轉(zhuǎn)基因植株能夠維持較低的細(xì)胞溶質(zhì)勢，可能是由于細(xì)胞內(nèi)積累了更多的細(xì)胞溶質(zhì)如糖、氨基酸等，從而更好地維持細(xì)胞滲透壓，避免干早脅迫造成的傷害。

曹燕燕等[2]的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)rolB基因不僅顯著提高轉(zhuǎn)基因棉花的莖粗，而且明顯增強(qiáng)了其生根能力，與野生型植株的根冠比存在顯著差異，抗旱性更強(qiáng)。王娟[3]對棉花各個(gè)生長階段抗旱性進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)外源ZmPIS基因不僅提高了轉(zhuǎn)基因棉花苗期、蕾期和盛花期的抗旱性，而且在開花期進(jìn)行長期干旱處理后，轉(zhuǎn)基因株系中同樣培育出單株產(chǎn)量顯著高于對照組的株系。

為了得到聚合多個(gè)抗旱基因的棉花植株，通過有性雜交將betA基因與TsVP基因聚合到同一棉花植株中。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)聚合基因棉花植株中，betA基因與TsVP基因的表達(dá)都得到驗(yàn)證，并通過各自不同的抗旱機(jī)制發(fā)揮生物學(xué)功能，與轉(zhuǎn)單個(gè)基因的棉花植株相比，進(jìn)一步提高了棉花在干旱條件下的適應(yīng)能力，為培育抗旱棉花新品種提供了新材料。吳偉[4]在前人研究的基礎(chǔ)上，將ZmPLC1基因和betA基因聚合在同一植株中，在轉(zhuǎn)基因棉花的苗期、蕾期和花期進(jìn)行干旱處理，也證明了聚合表達(dá)可以進(jìn)一步提高棉花的抗旱性。這也表明了通過基因聚合手段提高植物抗逆性是可行的。楊云堯[5]的研究也說明了轉(zhuǎn)MvP5CS和轉(zhuǎn)MvNHX1基因棉花在干旱脅迫下相對于野生型植株有更強(qiáng)的抗旱性；分析田間農(nóng)藝性狀的數(shù)據(jù)表明，兩種轉(zhuǎn)抗逆基因的棉花株系在干旱處理和正常條件下各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著，而野生型棉花各項(xiàng)數(shù)據(jù)均比其在正常培養(yǎng)條件下要低，說明轉(zhuǎn)抗逆基因的棉花植株在一定程度上提高了植株對逆境的適應(yīng)性。蔡永智[6]對轉(zhuǎn)CBF1和KatG基因棉花的高代材料進(jìn)行干旱處理，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因棉花在各項(xiàng)光合參數(shù)、生理指標(biāo)和農(nóng)藝性狀調(diào)查方面相對于對照組均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的適應(yīng)能力。這說明轉(zhuǎn)CBF1和KatG基因棉花能提高植株的抗旱性，進(jìn)而提高了棉花的產(chǎn)量。因此，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高棉花抗旱性將是棉花抵抗干旱和減少灌溉次數(shù)的有效手段。

2 轉(zhuǎn)基因棉花的抗蟲性

早在1986年，美國Agracetus公司利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，首次將蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）基因?qū)朊藁ǎ@得穩(wěn)定遺傳的抗蟲性，就開創(chuàng)了抗蟲棉花的新紀(jì)元。隨著謝道聽等[7]轉(zhuǎn)Bt基因棉花的成功培育，使我國成為世界上第二個(gè)擁有轉(zhuǎn)基因抗蟲棉技術(shù)的國家。1992年，郭三堆等[8]又通過添加增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平基因的方式，改造BtCryIA殺蟲晶體蛋白基因結(jié)構(gòu)，篩選出了抗蟲能力更強(qiáng)的抗蟲棉。另外，美國孟山都公司將豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI）轉(zhuǎn)入陸地棉品種，在室內(nèi)進(jìn)行生物活性測定，結(jié)果表明該轉(zhuǎn)基因棉花對棉鈴蟲和棉象蟲具有很好的抗性。陳志賢等[9]成功將CpTI基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入棉花中，隨后通過構(gòu)建雙價(jià)表達(dá)載體獲得了轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因的棉花新品種。

張寶紅[10]的研究表明，除了Bt基因和CpTI基因被應(yīng)用于棉花抗蟲基因工程外，糖分代謝過程中α-淀粉酶的抑制基因和抑制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的蝎毒素、促進(jìn)昆蟲蛻皮的脫皮激素等基因，都可整合進(jìn)植物基因組，達(dá)到增強(qiáng)植株抗蟲性的目的。郭金英[11]認(rèn)為轉(zhuǎn)Bt+Sck雙價(jià)基因棉花在三個(gè)不同的生長發(fā)育階段都對棉鈴幼蟲有較好的抗性，但不同生育期對棉鈴蟲的抗性有所不同，苗期抗蟲性最強(qiáng)，其次是盛花期，即使到鈴期轉(zhuǎn)基因棉花的抗蟲能力仍然很強(qiáng)。

3 轉(zhuǎn)基因棉花的耐鹽性

與其它作物相比，棉花本身具有一定的耐鹽性，并且因品種和生育期不同，其耐鹽能力存在差異。棉花苗期對鹽敏感程度最強(qiáng)，而且許多研究表明部分棉花品種的耐鹽能力在不同生長期與苗期的抵抗鹽脅迫的能力的是相對應(yīng)的。

孫小芳等[12]測定了13個(gè)棉花品種在不同鹽濃度脅迫下的相對萌發(fā)率、苗期相對葉面積和株高等指標(biāo)，結(jié)果表明不同棉花品種的耐鹽性與生長階段相對應(yīng)；蘇棉8號和10號的耐鹽性前期低于后期；而中棉所19號生育前期的耐鹽性明顯強(qiáng)于后期；另外，泗棉2號和蘇棉12號整個(gè)生育期耐鹽能力較弱。這些結(jié)果對于篩選耐鹽棉花品種具有指導(dǎo)意義。

呂素蓮將鹽芥TsVP基因轉(zhuǎn)入棉花中，也顯著提高了轉(zhuǎn)基因棉花在苗期的耐鹽能力。經(jīng)鹽處理過表達(dá)TsVP基因，促使Na+進(jìn)入液泡，從而削弱了細(xì)胞質(zhì)中過量Na+積累對細(xì)胞膜乃至整個(gè)細(xì)胞的傷害。

張慧軍等[13]以泗棉3號棉花的下胚軸為材料，將山菠菜AhCMO基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入其基因組中，鹽脅迫試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)AhCMO基因的棉花耐鹽性顯著優(yōu)于對照組棉株，說明AhCMO基因提高了轉(zhuǎn)基因棉花對鹽脅迫的耐受性。

連麗君[14]的研究表明，經(jīng)250mM的NaCl處理，轉(zhuǎn)betA基因的棉花種子出苗率優(yōu)于對照；250mMNaCl脅迫處理21 d后，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M的植株葉片失水過快，相對含水量從80.79%下降到48.54%，而轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出較好的抗性，作為滲透保護(hù)物質(zhì)的可溶性糖、游離氨基酸等的含量均高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?；脅迫后轉(zhuǎn)基因植株的葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量都較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑?，這表明轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞膜損傷和膜脂過氧化的程度較輕；另外，轉(zhuǎn)基因植株的光合作用系統(tǒng)受到鹽脅迫的影響也較輕，其凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率都明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡Ｔ趩沃曜衙蕻a(chǎn)量方面，轉(zhuǎn)基因植株也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍?/p>

謝得意等[15]設(shè)計(jì)不同濃度的NaCl處理棉花種子，結(jié)果表明NaCl濃度低于0.4%時(shí)，可促進(jìn)棉花種子萌發(fā)；但NaCl濃度超過0.7%時(shí)，棉花種子萌發(fā)受到抑制；而NaCl濃度低于0.5%的脅迫處理對棉花苗期的子葉面積、主根長、子葉含水量等影響都低于對照。

樊文菊[16]的研究表明，轉(zhuǎn)ZmPLC1基因棉花可正調(diào)控脯氨酸合成關(guān)鍵酶（P5CS）基因，負(fù)調(diào)控脯氨酸降解關(guān)鍵酶（ProDH）基因，使胞內(nèi)脯氨酸的含量增加，有利于細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)。除此之外，還通過與Ca2+調(diào)節(jié)的抗氧化防御系統(tǒng)的共同作用，維持細(xì)胞正常光合作用，提高轉(zhuǎn)基因棉花的抗鹽能力。

植物的耐鹽性受多條代謝途徑的多個(gè)基因調(diào)控，而轉(zhuǎn)單一基因僅能在一定程度上提高植物的耐鹽性。因此，可以嘗試將多個(gè)耐鹽相關(guān)基因通過基因聚合的方式導(dǎo)入到同一個(gè)植物中，可能對植物的耐鹽性會(huì)有更大程度地提高。

4 轉(zhuǎn)基因棉花的抗寒性

大量研究表明，棉花對低溫非常敏感，特別在西北內(nèi)陸棉區(qū)，低溫直接影響棉花的產(chǎn)量。因此，提高棉花的抗寒性是提高西北內(nèi)陸棉區(qū)產(chǎn)量的有效途徑。

連麗君的研究表明，在15℃培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)betA基因棉花種子的出苗率與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾嬖陲@著差異；經(jīng)5℃冷脅迫處理24 h，非轉(zhuǎn)基因棉花葉片的相對含水量明顯比轉(zhuǎn)基因棉花下降快，而轉(zhuǎn)基因棉花的相對電導(dǎo)率明顯低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。這表明低溫脅迫對轉(zhuǎn)基因棉花葉片細(xì)胞膜的損傷程度低，提高了棉花的抗寒性。酶活性測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花的SOD酶活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因棉花，體內(nèi)自由基的清除能力較強(qiáng)，可保護(hù)細(xì)胞避免過度氧化。低溫條件下轉(zhuǎn)基因棉花的胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度、凈光合速率和蒸騰速率與非轉(zhuǎn)基因棉花存在顯著差異，轉(zhuǎn)基因棉花與非轉(zhuǎn)基因棉花相比，其參與光合作用的元件低溫?fù)p傷較輕。

陳亮亮[17]將昆蟲抗凍蛋白基因Mpafp149通過花粉管通道法導(dǎo)入北疆棉區(qū)主栽品種中，經(jīng)過低溫處理，轉(zhuǎn)Mpafp149基因的棉花植株受低溫傷害的程度較輕，其葉片的丙二醛含量和相對離子滲漏率均小于非轉(zhuǎn)基因棉花，說明轉(zhuǎn)基因植株在冷脅迫后質(zhì)膜的傷害程度較輕，提高了棉花的抗寒性。

隨著轉(zhuǎn)基因棉花抗寒性的提高，棉花的播種時(shí)間也可以適當(dāng)提前，在霜凍來臨之前完成生活史，避免因低溫造成的棉花減產(chǎn)。

5 轉(zhuǎn)基因棉花的抗除草劑特性

在棉花的生長過程中往往存在雜草競爭，在營養(yǎng)、光照、水分和空間等資源有限的情況下，雜草競爭將直接影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，為了減少雜草的危害，人們逐漸在棉花生長過程中適當(dāng)使用除草劑。

早在上世紀(jì)70年代，歐洲千里光（Senecio vulgaris）對均一三氮苯除草劑就具有抗性，隨后在許多雜草和微生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了低抗除草劑的基因，因此選育出抗除草劑的棉花新品系對除草劑的使用具有重要意義[18]。

劉東軍等[19]在對草甘膦處理的棉花品系Y18的抗性研究中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)不同的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因EPSPS l和EPSPS2。李燕[20]將EPSPS基因轉(zhuǎn)入陸地棉當(dāng)中，以3～6 g/L的除草劑進(jìn)行篩選，獲得了兩個(gè)抗草甘膦株系S06-1和S06-2。除此之外，來源于土壤潮濕霉菌的Bar基因，通過編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），可以把草丁膦的自由氨基乙?；?，最終表現(xiàn)出對草丁膦的抗性。楊沛艷[21]通過除草劑抗性試驗(yàn)，確定了大田棉花的草甘膦篩選濃度為0.4%；當(dāng)草甘膦濃度提高到0.8%時(shí)，對照棉花枯萎死亡；當(dāng)草甘膦濃度高達(dá)1.0%時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株枯萎死亡。

對抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花的研究結(jié)果表明，選擇合適的除草劑及噴施濃度，可以綜合提高勞動(dòng)生產(chǎn)效率和棉花產(chǎn)量。

6 轉(zhuǎn)基因棉花的抗病性

早在20世紀(jì)80年代我國多位科學(xué)家聯(lián)手合作將蘿卜抗真菌蛋白基因（Rs-6）、β-1，3-葡聚糖酶基因（Glu）、幾丁質(zhì)酶基因（Chi）等導(dǎo)入我國棉花的主栽品種中，篩選出一系列抗黃萎病和抗枯萎病的棉花株系。李莉等[22]將木霉幾丁質(zhì)酶基因（TvChi）利用花粉管通道法導(dǎo)入4個(gè)新疆陸地棉品種（系）中，并通過病圃抗病性檢測，在T2代植株中選育了30株具較高抗黃萎病能力的棉花。程紅梅等[23]同樣利用花粉管通道法將幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶基因?qū)朊藁?，?jīng)鑒定后在溫室和病圃中進(jìn)行多代抗性篩選，成功培育出抗枯萎黃萎的轉(zhuǎn)基因棉品種（系）。王義琴等[24]將天麻抗真菌蛋白基因（GAFP）利用花粉管通道法導(dǎo)入新疆彩色棉品種中，通過分子鑒定和田間抗性篩選，獲得了高抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因棉花。黃駿麒等[25]將52-128的DNA片段導(dǎo)入兩個(gè)高感材料江蘇棉1號和江蘇棉3號中，獲得2個(gè)高抗品系3072（蘇1+52-128）和3049（蘇3+52-128），其后代表現(xiàn)出株高高于受體，結(jié)鈴數(shù)近似供體，生育期縮短、發(fā)病率下降的特性。石河子大學(xué)生物技術(shù)中心將菜豆幾丁酶和β-1，3-葡聚糖酶基因?qū)朊藁?，成功培育?8個(gè)抗病、抗蟲的轉(zhuǎn)基因棉花和1個(gè)高抗黃萎病品系（94-56）[26]。蔡應(yīng)繁等[27]首次采用基因槍法和葉盤法將抗真菌的β-1，3-葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入棉花基因組中，獲得了抗真菌基因的轉(zhuǎn)基因棉花。樂錦華等[28]成功構(gòu)建菜豆幾丁質(zhì)酶基因（BChi）與煙草β-1，3-葡聚糖酶基因（Nt-Glu）雙價(jià)植物表達(dá)載體pBLGC，并利用花粉管通道法導(dǎo)入新疆棉花主栽品種（系）中，通過分子檢測，并進(jìn)行病圃枯萎病抗病篩選，獲得抗病性突出和遺傳性穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因棉花。雷江榮[29]從分子生物學(xué)鑒定、致病菌接菌鑒定、病程相關(guān)蛋白表達(dá)、防御酶系分析和組織結(jié)構(gòu)抗性分析等多個(gè)角度對T1代轉(zhuǎn)基因棉株進(jìn)行枯萎病抗性分析，結(jié)果均證明棉花轉(zhuǎn)入snc1基因后能夠有效的提高棉株對棉花枯萎病的抗性，為棉花抗病機(jī)理研究做了有益探索。

7 展望

近年來，雖然棉花抗逆基因工程的發(fā)展迅速，但仍然面臨著一些問題，例如：對抗逆分子機(jī)制缺乏足夠的了解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因育種存在盲目性；有利性狀基因聚合的相關(guān)研究較少，而采用單一基因轉(zhuǎn)化，不同品種間的表達(dá)存在差異；利用過表達(dá)啟動(dòng)子（35S）驅(qū)動(dòng)抗逆基因高水平表達(dá)時(shí)有可能造成畸形植株的產(chǎn)生；外源基因轉(zhuǎn)化方法和體系的建立還有待進(jìn)一步完善等。因此，今后有關(guān)轉(zhuǎn)基因棉花抗逆性的研究可以從以下方面開展：（1）篩選培育出重要農(nóng)藝性狀的棉花群體，開展棉花遺傳分子圖譜的研究；（2）通過突變體技術(shù)，建立棉花突變庫，結(jié)合生物信息學(xué)，研究棉花抗逆相關(guān)基因的表達(dá)方式和調(diào)控機(jī)制，從而闡明其分子機(jī)制；（3）建立和優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系及方法，提高轉(zhuǎn)基因棉花的轉(zhuǎn)化效率；（4）將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和特異性表達(dá)的啟動(dòng)子有效組合，實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)的精確調(diào)控，避免組成型啟動(dòng)子帶來的負(fù)面影響；（5）對轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行有效地評價(jià)，可以提高轉(zhuǎn)基因棉花抗逆品種培育的效率和效果。

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