裴麗玲綜述，李建生，任維華審校

·綜述·

miRNAs與肝細胞癌發(fā)生研究進展*

裴麗玲綜述，李建生，任維華審校

MicroRNAs（miRNAs）是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼小分子RNA,參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的異常表達與疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs在不同癌癥中水平不同。研究證明，miRNAs可以作為肝細胞癌分類、預(yù)后和早期診斷的生物學(xué)標志，并有望成為體內(nèi)治療的新靶點。本文對各類miRNAs小分子與肝細胞癌發(fā)生的關(guān)系，及其在臨床上的應(yīng)用潛能等進行了介紹。

肝細胞癌；MicroRNAs；診斷；治療

微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一類內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，廣泛存在于各種真核生物中，它的異常表達與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)白血病、胃癌、肺癌、乳腺癌等癌癥中都有miRNA的異常表達。肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的癌癥之一，在癌癥死亡率中位居第三[1]。miRNAs在HCC中作為癌基因或抑癌基因已得到了證實，它對HCC早期診斷、篩查和治療具有潛在的臨床診療價值。本文就各類miRNAs小分子與肝細胞癌的關(guān)系及其在臨床上應(yīng)用的潛能等進行綜述，從而進一步認識肝細胞癌發(fā)生的分子機理。

1 miRNA的功能和特點及其在腫瘤發(fā)生中的通用機制

miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，其大小長約21-25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。

最近的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與生命過程中多種調(diào)節(jié)途徑，包括早期發(fā)育、細胞增殖和凋亡等，而且miRNAs表達與多種腫瘤相關(guān)，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因和抑癌基因的重要作用。在胃癌中miR-23a表達上調(diào)，是一個癌基因，轉(zhuǎn)錄后通過靶基因干擾素調(diào)節(jié)因子1促進細胞增殖和集落形成[2]。Kuo等[3]發(fā)現(xiàn)miR-33a是一個潛在的腫瘤抑制基因，miR-33a在肺癌細胞中表達下調(diào)，與肺癌病人的預(yù)后有關(guān)，miR-33a超表達，肺癌病人預(yù)后差。此外miRNAs還與癌癥進展有關(guān)，乳腺浸潤性癌中miR-27a明顯上調(diào)，而且miR-27a的表達與病理變化包括腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，miR-27a與乳腺癌進展明顯相關(guān)[4]。

2 miRNAs與HCC

2.1 miRNAs與HCC的發(fā)生機制肝癌的發(fā)生是多基因參與、多步驟發(fā)生的過程。截止2012年8月，人體組織共發(fā)現(xiàn)約1600種前體miRNAs，約2042種成熟miRNAs，其中許多都與肝癌相關(guān)。研究表明，miRNAs作為癌基因或抑癌基因參與了HCC的發(fā)生過程，并且通過其靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用。

在HCC中miR-221、miR-122等的異常表達已有多篇文獻報道，每種異常的miRNAs都通過多重靶基因調(diào)節(jié)，激活多條癌癥途徑來發(fā)揮作用。miR-221在HCC中有70～80%表達上調(diào)，是一個明確的癌基因，其靶基因是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN1B/p27），體外可促進腫瘤細胞生長。用肝癌的老鼠模型顯示miR-221超表達可以刺激致瘤的小鼠肝祖細胞生長，說明miR-221是一個癌基因[5]。在分子水平，miR-221通過多重靶基因調(diào)節(jié)影響了一些通路，研究表明miR-221利用細胞循環(huán)原理來控制細胞生長，尤其是細胞循環(huán)控制蛋白中miR-221抑制了細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑CDKN1B/p27[6]和CDKN1C/p57[7，8]。

miR-122是一個腫瘤抑制基因，可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和阻止細胞周期，抑制體內(nèi)肝癌細胞株的腫瘤發(fā)生[9]。對照癌旁組織miR-122在HCC組織和細胞中顯著下調(diào)，超表達miR-122顯著抑制增殖，促進HepG2和Hep3B細胞凋亡，超表達miR-122還下調(diào)蛋白Wnt1、β-catenin和TCF-4的表達水平，表明miR-122在HCC中表達下調(diào)，超表達miR-122通過Wnt/β-catenin-TCF信號通路抑制HCC細胞生長[10]。

隨著DNA測序技術(shù)的進步，利用深度測序技術(shù)在許多惡性腫瘤中檢測出了miRNAs組的序列，這些非編碼小RNAs在腫瘤的形成過程中發(fā)揮了越來越重要的作用，但在HCC中非編碼小RNAs特別是非編碼miRNAs仍是空白。2013年1月，Law等[11]通過DNA深度測序和生物信息學(xué)分析，在肝腫瘤形成中發(fā)現(xiàn)了一個新的和PIWI蛋白相關(guān)聯(lián)的非編碼RNA（piRNA）-piR-Hep1，對照相關(guān)的癌旁組織，46.6%HCC腫瘤中有piR-Hep1上調(diào)；沉默piR-Hep1則抑制細胞活力及侵襲力，而且伴隨AKT磷酸化作用減少。對miRNAs進行分析，發(fā)現(xiàn)在HCC中大量表達miR-1323，而且與肝硬化引起的肝癌相關(guān)，在肝硬化相關(guān)的肝癌中超表達miR-1323與無病生存率和總體生存率相關(guān)。

2.2 miRNAs與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移miRNAs不僅與HCC發(fā)生有關(guān)，而且與HCC侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。越來越多的研究表明，miRNAs的異常表達與腫瘤的惡變和發(fā)展關(guān)系密切。Chen等[12]研究了miR-100在HCC中的表達及其與臨床病理和預(yù)后的關(guān)系，同時對miR-100在HCC細胞中生長和凋亡的分子機制進行研究，結(jié)果顯示miR-100是一個抑癌基因，miR-100在HCC組織中明顯低于癌旁組織，同時低表達miR-100與HCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TMN分期及高復(fù)發(fā)率相關(guān)，此外，還發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（polo-like kinase 1，PLK1）使miR-100上調(diào)，可以抑制HCC細胞生長，增加細胞凋亡，而且miR-100的低表達與HCC臨床病理特征和不良預(yù)后有關(guān)。說明miR-100通過靶基因PLK1發(fā)揮腫瘤抑制劑作用，在HCC中可作為預(yù)后標志和治療靶標。

最新研究發(fā)現(xiàn)，HCC中miR-140-5p發(fā)揮抑制劑的作用，通過靶基因轉(zhuǎn)化生長因子β受體1（transforming growth factor B receptor 1，TGFBR1）和轉(zhuǎn)化生長因子9（transforming growth factor9，F(xiàn)GF9）抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移。在不同HCC分型中對比miRNA的表達，發(fā)現(xiàn)miR-140-5p是HCC相關(guān)的一個miRNA，在肝癌組織和肝癌細胞中miR-140-5p明顯下調(diào)，而且它的表達與多結(jié)節(jié)形成、靜脈入侵和莢膜形成有關(guān)，還與無病生存率和總體生存率有關(guān)；siRNA法沉默TGFBR1和FGF9的表達，能夠模擬miR-140-5p異常表達的腫瘤抑制表型，而TGFBR1和FGF9的高表達則減弱了miR-140-5p對HCC增殖和轉(zhuǎn)移的抑制效應(yīng)。故在HCC發(fā)生發(fā)展中miR-140-5p可作為一個有價值的腫瘤預(yù)后指標[13]。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-503可以同時下調(diào)FGF2和血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）兩個潛在的血管生成因子。在HCC細胞和原發(fā)腫瘤組織中miR-503的表達由于表觀遺傳機制被抑制，體內(nèi)外超表達miR-503都可減少腫瘤血管生成，而且缺氧通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）使miR-503表達下調(diào)，表明一個miRNA在癌癥中有FGF2和VEGFA兩個靶基因，提示miR-503在腫瘤生成中的抗血管生成作用，說明缺氧通過HIF-1α誘導(dǎo)FGF2和VEGFA間接抑制miR-503[14]。另外在高轉(zhuǎn)移潛能的HCC細胞株HCCLM3對照低轉(zhuǎn)移潛能的HCC細胞株MHCC97-L中，miR-503顯著下調(diào)，這些說明miR-503在HCC腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮腫瘤抑制劑的作用[15]。

2.3 循環(huán)miRNAs對HCC的診斷價值循環(huán)miRNAs作為生物標志用于病人的早期診斷和隨訪是近來研究的熱點。與HCV相關(guān)和不相關(guān)的HCC中血清miR-21可作為一個指標[16]。Bihrer等[20]研究了62例慢性丙肝病毒（chronic hepatitis C virus infection，CHC）感染者，29例丙肝病毒感染發(fā)展成HCC患者，19例健康對照，提取血清中的miR-21，用miR-16作內(nèi)參，qRT-PCR方法檢測，發(fā)現(xiàn)miR-21與HCC組織學(xué)分級和分期相關(guān)，結(jié)果顯示CHC病人相對正常人升高，而CHC和CHC相關(guān)的HCC病人血清miR-21無明顯差別。血清miR-21與組織學(xué)活性指數(shù)（HAI）、ALT、AST、BIL、國際標準化比率和r-GT相關(guān)。血漿miR-21作為HCC的一個新的生物標志，術(shù)后比術(shù)前明顯降低[17]。血清miR-18a在乙肝相關(guān)HCC中顯著升高，可作為乙肝相關(guān)HCC的潛在生物標志[18]。Li等[19]報道了三種miRNAs（miR-25，miR-375和let-7f），而且通過控制可以獨立的出現(xiàn)在肝癌中。miR-375有96%特異性100%敏感性。Zhou等[20]研究了七種循環(huán)miRNAs，其中四種miRNAs（miR-122，miR-223，miR-26，miR-27a）表達上調(diào)，三種miRNAs（miR-192，miR-21，miR-801）表達下調(diào)，發(fā)現(xiàn)這七種miRNAs是診斷HCC的循環(huán)標志物，對診斷HCC有高準確性，特別是對早期巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）診斷。令人困惑的是，不同研究團隊不同的實驗設(shè)計，以上結(jié)果尚存在矛盾的研究結(jié)果，在臨床使用之前還需大量的實驗證明。

2.4 miRNAs在HCC分期和預(yù)后分析及在HCC治療中的價值目前對HCC的分期和預(yù)后主要是依據(jù)臨床指標[21～23]：如腫瘤狀態(tài)（結(jié)節(jié)數(shù)量和大小，出現(xiàn)血管入侵和肝外擴散）、肝臟功能、有無門脈高壓等。miRNAs的表達可以提高我們對HCC分期和預(yù)后分析能力，與病理生理和臨床參數(shù)相聯(lián)系，可能成為HCC分期和預(yù)后的潛在分子標志。Budhu等[24]研究顯示20種miRNAs與靜脈入侵有關(guān)，Budhu等研究的結(jié)果可能與HCC的早期分期有關(guān)，他們提供了一個更為理性的干預(yù)治療方法。在miRNAs中miR-125b抑制HCC細胞株中細胞生長，高表達時與HCC病人的高生存率有關(guān)[25]；miR-122的下調(diào)與肝癌患者肝內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)，降低miR-122與短時間復(fù)發(fā)有關(guān)[26]；低miR-22表達預(yù)示HCC病人低生存率[27]；miR-139是一個轉(zhuǎn)移抑制劑，在轉(zhuǎn)移瘤中發(fā)現(xiàn)它下調(diào)，miR-139的下調(diào)增加了體內(nèi)HCC細胞的侵襲能力和HCC轉(zhuǎn)移能力，低miR-139病人預(yù)后差[28]；在HCC中上調(diào)的miRNAs中miR-221 抑制了腫瘤抑制蛋白包括CDKN1B/p27 和CDKN1C/p57的表達，與短期復(fù)發(fā)率有關(guān)[29]。因此，miRNAs單獨或者結(jié)合其他參數(shù)可能成為HCC分期和預(yù)后標志。

人類腫瘤發(fā)生中分子途徑參與的靶基因治療已經(jīng)成為腫瘤治療最理想的方法。目前多重抑制劑索拉菲尼通過阻斷VEGFR和血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）已被應(yīng)用到晚期肝癌的治療中。HCC中miRNAs的發(fā)現(xiàn)使我們對HCC分子機理有了進一步的認識，miRNAs可能成為靶基因治療的重要手段。Kota和Coworkers[30]通過動物模型成功的證明了miR-26a的抗腫瘤作用。Ji等[31]發(fā)現(xiàn)HCC病人中，非瘤肝組織中miR-26a和miR-26b的表達女性比男性高，腫瘤組織中miR-26降低，miR-26降低與NF-κB和Il-6在腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮作用有關(guān)，而且低表達的miR-26的病人生存率低。腫瘤在體內(nèi)用反義寡苷酸進行抗癌治療也取得了很大進展，用miR-21的反義寡苷酸治療癌癥，許多癌癥細胞出現(xiàn)了生長抑制，凋亡增加，而且被反義寡苷酸抑制的miR-21增加了化療的敏感性[32，19]，可見miRNAs或其反義寡苷酸在癌癥的臨床治療上有很大的可行性。

3 展望

綜上所述，miRNAs與HCC等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。研究miRNAs對腫瘤臨床的早期診斷、分期、預(yù)后、治療等具有重要意義。雖然對miRNAs在癌癥發(fā)展方面的認識正在提高，但它仍不完整。特別是幾個相關(guān)問題需要解決：①在HCC中發(fā)現(xiàn)的所有miRNAs對腫瘤的發(fā)展都至關(guān)重要嗎？②為什么不同團隊研究的miRNAs結(jié)果不可重復(fù)甚至相反? ③循環(huán)miRNAs的高穩(wěn)定性可使它們成為完美的生物標志，特別是疾病早期無癥狀階段。然而在HCC組織中某些miRNAs和病人血液之間缺乏對應(yīng)的原因仍不清楚。除此之外，循環(huán)miRNAs作為癌癥生物標志的可靠性還未經(jīng)過臨床驗證?？傊槍υS多未解決的問題，進一步了解miRNAs調(diào)控腫瘤發(fā)生的機制是目前急需解決的問題和挑戰(zhàn)，它可能在診斷和治療癌癥方面推動創(chuàng)新概念的發(fā)展。

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（收稿：2013-06-19）

（校對：張駿飛）

Progress in microRNAs in the development of hepatocellular carcinoma

PeiLiling，LiJiansheng，RenWeihua. Department of Clinical Laboratory，Anhui Provincial Hospital，Affiliated to Anhui Medical University，Hefei 230001，China

MicroRNAs（miRNAs）are a class of 21 to 25 nucleotides non-coding small RNAs that regulate post-transcriptionally gene expression. Recent findings show that the abnormal expression of miRNAs is closely related to a number of diseases，especially the development of malignant tumor. miRNAs are expressed at different levels in various cancers. Studies shows that miRNAs can be used as biological markers for histological classification，prognosis and early diagnosis of hepatocellular carcinoma，and are expected to become a new therapeutic target in vivo. In this paper，a number of known small miRNAs are reviewed for their effect in carcinogenesis in liver cancer.

Hepatocellular carcinoma；MicroRNAs；Diagnosis；Treatment

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.02.031

安徽省科技攻關(guān)項目（01013025）

230001合肥市安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗科（裴麗玲）；肝癌實驗室（李建生，任維華）

裴麗玲，女，37歲，碩士研究生，主管檢驗師。主要從事肝癌早期診斷研究。E- mail：1419869996@qq.com

任維華，E- mail：weihuaren@sina.com