張君瑩，吳建中，季明華，張 燁，尹 麗，徐 濤，羅 舟，馬 蓉，曹海霞，唐金海

乳腺癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)，居女性惡性腫瘤之首，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成治療失敗和患者死亡的主要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變和血管生成是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在此過(guò)程中起到了重要作用。MMPs通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞間接觸等方式促進(jìn)上皮細(xì)胞與周圍組織分離，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。VEGF是目前已知的最關(guān)鍵、作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)刺激因子，促進(jìn)毛細(xì)血管袢形成并向瘤體內(nèi)延伸，加速腫瘤組織生長(zhǎng)，此外通過(guò)增加血管通透性，協(xié)助腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng)，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。VEGF和MMPs均參與惡性腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移過(guò)程，且兩者可能存在協(xié)同作用[1]。相較于傳統(tǒng)的ELISA等檢測(cè)方法，液相芯片分析技術(shù)有其明顯優(yōu)勢(shì)，芯片技術(shù)靈敏度更高，精確值亦可達(dá)到0.01 pg/ml。本研究通過(guò)高通量液相芯片技術(shù)檢測(cè)了正常人、良性乳腺纖維瘤和乳腺癌患者血清MMP-9和VEGF的表達(dá)，旨在探討其表達(dá)水平在乳腺癌臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中的意義。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 收集2011年9月至2012年12月在江蘇省腫瘤醫(yī)院就診的384例患者以及未罹患乳腺相關(guān)疾病的正常人40例，均為女性，其中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(infiltrative ductal carcinoma, IDC) 301例，其中有118例IDC患者于術(shù)后復(fù)查VEGF、MMP-9；乳腺纖維瘤患者83例，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)UICC建議的TNM分期將IDC組分為Ⅰ期125例，Ⅱ期58例，Ⅲ期98例，Ⅳ期20例；其中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為127例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為166例，未查到有無(wú)轉(zhuǎn)移為8例。本研究符合倫理學(xué)要求，口頭告知實(shí)驗(yàn)情況并經(jīng)患者同意簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集 抽取患者及正常人清晨空腹靜脈血3 ml，將采集的靜脈血放于無(wú)內(nèi)毒素和熱源的試管中，上下振搖3次，室溫凝血30 min后2 500 rpm/min離心10 min。吸取血清，分裝后放于-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 儀器與試劑 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法采用液相芯片分析技術(shù)，F(xiàn)LEXMAP 3DTM(三維)系統(tǒng)由Luminex公司(USA)提供。用來(lái)檢測(cè)血清中VEGF和MMP-9的試劑盒Human Cytokine/Chemokine和Human CVD Panel 1均購(gòu)自上海Millipore貿(mào)易有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟 操作步驟嚴(yán)格遵循說(shuō)明書。將收集在-80 ℃的血清放置4 ℃解凍，取200 μl血清至96孔板?；旌暇鶆蛩芰现榕c緩沖液，將混懸液每孔25 μl加至標(biāo)本檢測(cè)板中。然后逐步加入陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)標(biāo)本，25 μl每孔(以上操作均在冰上進(jìn)行)。依次加入檢測(cè)緩沖液，每孔25 μl。于室溫中振搖標(biāo)本檢測(cè)板，VEGF：16 h，MMP-9：2 h。洗板兩次后，每孔50 μl加入檢測(cè)抗體至標(biāo)本檢測(cè)板。室溫振搖1 h，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白液。兩次洗板完畢后每孔100 μl向標(biāo)本檢測(cè)板中加入洗液。室溫中振搖5 min。蛋白質(zhì)全定量檢測(cè)，開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 min，設(shè)定儀器參數(shù)為如下，Events：50；Gate：8 000～15 000；Sample Size：VEGF 100 μl，MMP-9 50 μl；Time Out：60 s；Bead Region：VEGF 86#，MMP-9為27#。在檢測(cè)池中放入標(biāo)本檢測(cè)板，運(yùn)行相關(guān)檢測(cè)程序。最后用Xponent 4軟件分析檢測(cè)中產(chǎn)生的微球中位熒光讀數(shù)，并獲得最終結(jié)果，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗(yàn)。兩組間比較采用獨(dú)立樣Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較采用獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis單因素檢驗(yàn)。兩因子間相關(guān)分析采Spearman等級(jí)相關(guān)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用ROC曲線下面積分析評(píng)估血清中VEGF和MMP-9的水平對(duì)IDC患者的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中VEGF和MMP-9的表達(dá) 各組血清中VEGF和MMP-9的水平見(jiàn)表1,血清中VEGF和MMP-9在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中的表達(dá)明顯高于乳腺纖維患者和正常人(均P<0.05)。

表1 各組血清中VEGF、MMP-9的比較

2.2 手術(shù)治療后IDC患者血清中VEGF和MMP-9的變化 118例IDC患者術(shù)后復(fù)查血清VEGF、MMP-9表達(dá)量分別(135.26±131.20) pg/ml和(680.36±551.77) ng/ml，與術(shù)前的(180.89±167.82) pg/ml和(903.92±704.76) ng/ml相比，表達(dá)水平明顯下降(均P<0.05)。

2.3 VEGF和MMP-9與臨床病理特征的關(guān)系 IDC患者血清中VEGF和MMP9與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系見(jiàn)表2。乳腺癌患者血清中VEGF、MMP-9表達(dá)水平與年齡無(wú)關(guān)(均P>0.05)；而與臨床分期、原發(fā)灶大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.01)。

表2 MMP-9和VEGF與未治療組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌IDC臨床病理特征的關(guān)系

2.4 VEGF和MMP-9兩者間的相關(guān)性 用Spearman秩和檢驗(yàn)分析顯示血清中VEGF和MMP-9兩者的表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.601，P<0.01)，如圖1所示。

圖1 VEGF和MMP9的相關(guān)性分析

2.5 VEGF和MMP-9對(duì)于IDC的診斷價(jià)值 VEGF的ROC曲線下面積為0.788(95%置信區(qū)間：0.711～0.864)，而MMP-9曲線下面積為0.861(95%置信區(qū)間:0.806～0.916)。由此可見(jiàn)，血清VEGF和MMP-9對(duì)于IDC的診斷均具有一定的可信性。

圖2 VEGF和MMP-9對(duì)于IDC診斷價(jià)值的ROC曲線

3 討論

新生血管形成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、氧氣，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)旁分泌作用及產(chǎn)生腫瘤生長(zhǎng)啟動(dòng)因子，直接促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。腫瘤血管的生成一般是促進(jìn)血管生成因子和抑制血管生成因子之間達(dá)到了某種動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。在眾多促血管生成因子中，VEGF已經(jīng)被公認(rèn)為是作用很強(qiáng)的因子之一，其是一種內(nèi)皮細(xì)胞中特異性的有絲分裂原，通過(guò)與血管生成血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)結(jié)合，強(qiáng)有力的增加血管通透性。MMP-9則可以通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的生物利用度從而同樣促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)，也可調(diào)節(jié)生成的腫瘤血管的穩(wěn)定性和滲透性。

本研究結(jié)果顯示，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)、乳腺纖維瘤以及正常人群中，IDC組VEGF和MMP-9的表達(dá)量明顯高于后兩者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，良性病變?nèi)橄倮w維瘤組與正常人對(duì)比，前者血清VEGF和MMP-9的表達(dá)水平略高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兩者表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期關(guān)系密切。有文獻(xiàn)報(bào)道表明，隨著TNM分期的進(jìn)展，血清VEGF的表達(dá)水平也隨之升高[2]。另有報(bào)道無(wú)論在三陰性乳腺癌中還是雌激素依賴的乳腺腫瘤中，MMP-9的表達(dá)水平也隨著IDC的臨床病理分期的提高而增加[3]。本研究結(jié)果與以上報(bào)道結(jié)果結(jié)論相一致。進(jìn)一步分析VEGF和MMP-9與腫瘤大小以及年齡的關(guān)系，研究結(jié)果顯示VEGF和MMP-9的表達(dá)和腫瘤大小關(guān)系密切，隨著腫瘤體積的增大，VEGF和MMP-9的表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。此與Goldhirsch等[4]及Rakha等[5]的研究結(jié)果相似。故我們認(rèn)為患者血清中VEGF和MMP-9的表達(dá)水平與原發(fā)灶大小存在相關(guān)性，可以從某種程度上預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后。本研究顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清中VEGF和MMP-9的水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。VEGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞的滲透性，容易造成腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而MMP-9則能夠破壞基底膜，導(dǎo)致癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，VEGF和MMP-9的表達(dá)水平在一定層面上可以預(yù)示IDC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的高低。

此外，我們?cè)诜治鲅芯縑EGF和MMP-9的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，二者之間存在正相關(guān)。Riedel等[6]曾經(jīng)報(bào)道VEGF和MMP-9之間存在著協(xié)同作用，可以作為腫瘤血管生成與腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志。Zucker等[7]發(fā)現(xiàn)VEGF能夠間接促進(jìn)MMP-9的分泌并增加其活性。因此，聯(lián)合檢測(cè)VEGF和MMP-9的表達(dá)對(duì)于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究通過(guò)液相芯片分析技術(shù)在血清中檢測(cè)因子，較之外科手術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附等方法，其具有以下顯而易見(jiàn)的優(yōu)點(diǎn)：芯片技術(shù)靈敏度高，較傳統(tǒng)ELISA 法高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)值可以精確到0.01 pg/ml。液相環(huán)境對(duì)于生物大分子的天然構(gòu)象保持更有利，利于探針與檢測(cè)物的反應(yīng)；血樣標(biāo)本容易收集，成本較低，創(chuàng)傷小，患者接受程度高，容易操作，術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后均可檢測(cè)，可重復(fù)性好。利用液相芯片技術(shù)檢測(cè)血清中核酸、蛋白質(zhì)生物大分子，如臨床細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物等，較傳統(tǒng)ELISA法更準(zhǔn)確、靈敏與快速，高通量，重復(fù)性好，節(jié)省樣品和時(shí)間。

當(dāng)然，僅在血清中檢測(cè)VEGF和MMP-9可能有所局限。因?yàn)橛醒芯勘砻餮“鍟?huì)釋放VEGF至血清中，血清中的VEGF和血小板的計(jì)數(shù)高度相關(guān)。因此，有學(xué)者認(rèn)為檢測(cè)血漿中VEGF對(duì)于反映血循環(huán)中VEGF更精準(zhǔn)[8]。關(guān)于VEGF和MMP-9對(duì)于乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的預(yù)后等關(guān)系將來(lái)需要進(jìn)行大規(guī)模的研究證實(shí)。

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