杏鮑菇原生質(zhì)體制備條件的研究

何小慧+楊民和

摘 要：通過對酶系、酶解濃度、酶解時間、酶解溫度、酶解pH值、穩(wěn)壓劑濃度和杏鮑菇出發(fā)菌齡的探索，得出杏鮑菇原生質(zhì)體制備的條件。其制備條件為：培養(yǎng)5d的菌絲，在0.6mol/L甘露醇配制的2%溶壁酶里，pH 5.5，30℃，50r/min，酶解2.5h，可以獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量，產(chǎn)量為6.10×106 個/mL。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇；原生質(zhì)體；制備條件

中圖分類號 S646 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）06-15-03

杏鮑菇隸屬于擔(dān)子菌亞門、真擔(dān)子菌綱、層菌亞綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬。杏鮑菇菌肉肥厚，質(zhì)地脆嫩，營養(yǎng)豐富，是側(cè)耳屬中風(fēng)味較好的一類，有著廣闊的市場前景[1-2]。目前食用菌育種方法有野生食用菌馴化育種、孢子分離育種、雜交育種（單倍體交配）、誘變育種、細胞融合育種及轉(zhuǎn)基因育種等方法[3]。食用菌的原生質(zhì)體全能性較易得到，所以細胞融合育種將為更廣泛的使用。研究杏鮑菇原生質(zhì)體制備的條件，就是為對其進行細胞融合育種創(chuàng)造條件。由于真菌細胞的細胞壁成分較為復(fù)雜，不同種甚至同種不同菌株之間的原生質(zhì)體制備條件也需要進行原生質(zhì)體制備的條件摸索[4]。根據(jù)同類食用菌原生質(zhì)體制備技術(shù)的文獻[5-6]，本文對杏鮑菇原生質(zhì)體的制備條件進行探索。

1 材料與方法

1.1 菌株 本實驗室分離，子實體采自福建省福清市火麒麟食用菌技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 水解酶 溶壁酶（Lywallzyme），購自廣東微生物研究所；纖維素酶（cellulase），購自阿拉丁；蝸牛酶（snailase），購自北京鼎國昌是生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PDA培養(yǎng)基 將200g馬鈴薯煮至軟爛過濾取汁，加入葡萄糖20g，加水至1 000mL，pH自然。培養(yǎng)基經(jīng)常規(guī)高壓滅菌后備用。

1.3.2 菌絲體的培養(yǎng) 菌種于PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，從生長良好的菌落邊緣用10mm打孔器打取菌絲塊，接4塊菌餅到鋪有玻璃紙的PDA平板培養(yǎng)基上，28℃恒溫箱中培養(yǎng)4～7d。

1.3.3 酶液的配制 稱取一定量的酶溶于0.6mol/L的甘露醇滲透壓穩(wěn)定劑中，調(diào)到需要的酶濃度（m/v），用孔徑為0.22μm的細菌過濾器過濾除菌后備用。

1.3.4 原生質(zhì)體的制備 挑取培養(yǎng)好的菌絲置于無菌的10mL離心管中，加入一定量酶液進行酶解，因為菌絲長在玻璃紙上，沒有混雜培養(yǎng)基成分，無需洗滌可以直接用于酶解[7]。酶解一定時間后，吸取菌懸液，用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計算原生質(zhì)體的數(shù)量。

1.3.5 原生質(zhì)體制備條件的確定

1.3.5.1 酶系的選擇 用0.6mol/L甘露醇配置以上酶系，pH4.6，30℃，50r/min的條件下酶解菌絲3.0h，然后顯微鏡下進行計數(shù)，計算原生質(zhì)體的數(shù)量。

1.3.5.2 酶濃度的確定 分別用0.6mol/L的甘露醇配置不同濃度的酶液，溶壁酶的濃度（M/V）分別設(shè)置為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%。在30℃，pH4.6，50r/min，酶解菌絲3.0h，然后顯微鏡下進行計數(shù)。

1.3.5.3 酶解時間的確定 酶解時間設(shè)置為1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h和3.5h，在30℃，pH4.6的0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min條件下酶解菌絲，然后顯微鏡下進行計數(shù)。

1.3.5.4 酶解pH的確定 酶解環(huán)境分別設(shè)置了4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0等不同的pH值。在30℃，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min，酶解菌絲2.5h，然后顯微鏡下進行計數(shù)。

1.3.5.5 酶解溫度的確定 分別設(shè)置酶解溫度為26℃、28℃、30℃、32℃和34℃，pH5.5，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min，酶解菌絲2.5h，然后顯微鏡下進行計數(shù)。

1.3.5.6 穩(wěn)壓劑濃度的確定 根據(jù)參考文獻《杏鮑菇原生質(zhì)體制備與再生條件初探》和《杏鮑菇原生質(zhì)體制備技術(shù)的研究》得出，此菌使用甘露醇作為穩(wěn)定劑最佳，進而在此設(shè)計濃度不同的甘露醇溶液配制的2.0%酶液進行試驗，穩(wěn)壓劑濃度分別為0.4M/L、0.5M/L、0.6M/L、0.7M/L和0.8M/L，30℃，pH5.5，酶解菌絲2.5h，然后顯微鏡下進行計數(shù)。

1.3.5.7 最佳菌齡的確定 菌絲體在培養(yǎng)3d、4d、5d、6d、和7d后，分別在30℃，pH5.5，0.6mol/L甘露醇配制的2.0%酶液，50r/min的條件下，酶解菌絲2.5h，然后顯微鏡下進行計數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶系的選擇 蝸牛酶主要作用是降解幾丁質(zhì)，纖維素酶主要是將纖維素分解成寡聚糖和單糖，溶壁酶是一種復(fù)合型水解酶，能分解真菌細胞壁。蝸牛酶、纖維素酶和溶壁酶都普遍應(yīng)用于真菌原生質(zhì)體的制備，大多數(shù)食用的大型真菌使用溶壁酶或者溶壁酶和纖維素酶混合液進行原生質(zhì)體制備，但是不同的菌類也有用蝸牛酶和纖維素酶進行原生質(zhì)體制備的報道[8-9]。相對溶壁酶來說，若能使用蝸牛酶和纖維素酶進行原生質(zhì)體制備，則能節(jié)約成本，因而對常用的這3種酶分別進行單一酶系和混合酶系對杏鮑菇菌絲進行酶解。從圖1可以看出，單一使用溶壁酶就能獲得較多的杏鮑菇原生質(zhì)體。杏鮑菇菌絲對一般的纖維素酶和蝸牛酶不敏感，酶解3.0h還未能在顯微鏡下找到解開的菌絲碎片和原生質(zhì)體，但是使用單一的溶壁酶能得到較好的酶解效果，酶解3.0h后，原生質(zhì)體的濃度達到3.75×106個/mL。

2.2 酶濃度對原生質(zhì)體制備的影響 酶的濃度會對真菌原生質(zhì)體的形成有一定影響。在一定的濃度范圍內(nèi)，酶濃度越高，原生質(zhì)體產(chǎn)量增加明顯；但是當(dāng)酶濃度過大時，則會破壞原生質(zhì)體，影響原生質(zhì)體的制備。從圖2可以看出，當(dāng)溶壁酶濃度為2.0%（M/V）的時候，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達到4.35×106 個/mL。

2.3 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響 菌絲酶解一定時間，有活性的原生質(zhì)體產(chǎn)量會不斷增加，但是酶解時間過長，就會造成原生質(zhì)體長時間浸泡在酶液中導(dǎo)致細胞破裂，活性原生質(zhì)體數(shù)目下降。由圖3可以看到，酶解2.5 h的時候，活性原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最高，濃度為4.7×106 個/mL。

2.4 pH值對原生質(zhì)體制備的影響 酶在不同pH值環(huán)境下活性不一樣，pH值會影響酶的作用效果；不僅如此，pH值還會影響細胞膜的穩(wěn)定性，過高或過低的pH值都會對細胞膜產(chǎn)生不利影響[10]。根據(jù)圖4得出，當(dāng)pH5.5的時候，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，濃度為4.87×106個/mL；pH接近中性時，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯下降。

2.5 溫度的選擇 酶解溫度不僅會影響酶的活力，也會影響原生質(zhì)體的活力，所以酶解溫度偏高或偏低都會對最后形成的原生質(zhì)體數(shù)量有一定影響。由圖5得出，溫度在30℃以下，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯低于30℃及以上兩個溫度，并且溫度為30℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，原生質(zhì)體濃度為4.1×106個/mL。說明在30℃時，此酶的活性高，杏鮑菇的原生質(zhì)體產(chǎn)量高。

2.6 穩(wěn)壓劑濃度的選擇 穩(wěn)壓劑的存在，不僅能保證原生質(zhì)體細胞膜內(nèi)外壓力的恒定，保證原生質(zhì)體不易破裂，還有可能會促進酶與底物的結(jié)合。由圖6可以得出，滲透壓穩(wěn)定劑濃度過高或者過低對原生質(zhì)體的產(chǎn)量影響較明顯。本研究中，甘露醇濃度為0.6mol/L時杏鮑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，濃度達到6.05×106個/mL。

2.7 菌齡的選擇 菌絲的培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體的制備存在較大的影響，菌絲在不同的時期細胞壁結(jié)構(gòu)、菌體代謝水平和菌體活力都不一樣，不同菌在不同時期用于制備原生質(zhì)體產(chǎn)量也不一樣[11]。培養(yǎng)時間短，菌絲體產(chǎn)量低，不足夠酶解；而培養(yǎng)時間過長，則有可能導(dǎo)致菌絲老化難以被酶解。由圖7可以看到，杏鮑菇菌絲體培養(yǎng)5d后，制備的原生質(zhì)體數(shù)量最多，濃度達到6.10×106個/mL。

3 小結(jié)

通過以上單一變量的試驗表明，采用平板法培養(yǎng)菌絲5d，在pH5.5，用0.6mol/L的甘露醇作為穩(wěn)壓劑，2.0%濃度的單一溶壁酶條件下酶解菌絲2.5h，杏鮑菇的原生質(zhì)體制備效果最佳，其產(chǎn)量可以達到6.10×106個/mL。這一試驗表明對杏鮑菇進行細胞融合育種是可以進行的，可以完成構(gòu)建新品種的杏鮑菇的目的。

參考文獻

[1]馮偉林，蔡為明，金群麗，等.杏鮑菇擔(dān)孢子交配型的鑒定分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22（1）：100-104.

[2]王愛仙.不同碳氮比培養(yǎng)料對杏鮑菇菌絲生長的影響[J].浙江食用菌，2010，18（4）：20-21.

[3]桂明英，王剛，郭永紅，等.食用菌育種技術(shù)的研究進展[J].中國食用菌，2006，25（5）：3-5.

[4]付曉燕，范黎.粗柄羊肚菌原生質(zhì)體制備及再生技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（5）：35-37.

[5]劉敏，李娟，周波，等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備與再生條件初探[J].生物技術(shù)，2005，15（1）：54-55.

[6]陳敏，蔣予箭，姚善涇，等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備技術(shù)的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：155-152.

[7]陳漱涢，曹衛(wèi)軍.幾種絲狀真菌原生質(zhì)體的形成與再生[J].真菌學(xué)報，1986，5（2）：177-123. [8]何強泰，張李楊.大型真菌原生質(zhì)體技術(shù)的研究進展[J].南京曉莊學(xué)院學(xué)報，2001，17（4）：47-50.

[9]劉玉霞，王謙，陳瑞玲，等.白靈菇原生質(zhì)體制備及再生的研究[J].食用菌，2009，（4）：24-25.

[10]金衛(wèi)根.高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體制備的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（4）：111-113.

[11]譚文輝，李燕萍，許洋.微生物原生質(zhì)體制備及再生的影響因素[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：263-265.

（責(zé)編：張長青）

2.3 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響 菌絲酶解一定時間，有活性的原生質(zhì)體產(chǎn)量會不斷增加，但是酶解時間過長，就會造成原生質(zhì)體長時間浸泡在酶液中導(dǎo)致細胞破裂，活性原生質(zhì)體數(shù)目下降。由圖3可以看到，酶解2.5 h的時候，活性原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最高，濃度為4.7×106 個/mL。

2.4 pH值對原生質(zhì)體制備的影響 酶在不同pH值環(huán)境下活性不一樣，pH值會影響酶的作用效果；不僅如此，pH值還會影響細胞膜的穩(wěn)定性，過高或過低的pH值都會對細胞膜產(chǎn)生不利影響[10]。根據(jù)圖4得出，當(dāng)pH5.5的時候，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，濃度為4.87×106個/mL；pH接近中性時，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯下降。

2.5 溫度的選擇 酶解溫度不僅會影響酶的活力，也會影響原生質(zhì)體的活力，所以酶解溫度偏高或偏低都會對最后形成的原生質(zhì)體數(shù)量有一定影響。由圖5得出，溫度在30℃以下，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯低于30℃及以上兩個溫度，并且溫度為30℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，原生質(zhì)體濃度為4.1×106個/mL。說明在30℃時，此酶的活性高，杏鮑菇的原生質(zhì)體產(chǎn)量高。

2.6 穩(wěn)壓劑濃度的選擇 穩(wěn)壓劑的存在，不僅能保證原生質(zhì)體細胞膜內(nèi)外壓力的恒定，保證原生質(zhì)體不易破裂，還有可能會促進酶與底物的結(jié)合。由圖6可以得出，滲透壓穩(wěn)定劑濃度過高或者過低對原生質(zhì)體的產(chǎn)量影響較明顯。本研究中，甘露醇濃度為0.6mol/L時杏鮑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，濃度達到6.05×106個/mL。

2.7 菌齡的選擇 菌絲的培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體的制備存在較大的影響，菌絲在不同的時期細胞壁結(jié)構(gòu)、菌體代謝水平和菌體活力都不一樣，不同菌在不同時期用于制備原生質(zhì)體產(chǎn)量也不一樣[11]。培養(yǎng)時間短，菌絲體產(chǎn)量低，不足夠酶解；而培養(yǎng)時間過長，則有可能導(dǎo)致菌絲老化難以被酶解。由圖7可以看到，杏鮑菇菌絲體培養(yǎng)5d后，制備的原生質(zhì)體數(shù)量最多，濃度達到6.10×106個/mL。

3 小結(jié)

通過以上單一變量的試驗表明，采用平板法培養(yǎng)菌絲5d，在pH5.5，用0.6mol/L的甘露醇作為穩(wěn)壓劑，2.0%濃度的單一溶壁酶條件下酶解菌絲2.5h，杏鮑菇的原生質(zhì)體制備效果最佳，其產(chǎn)量可以達到6.10×106個/mL。這一試驗表明對杏鮑菇進行細胞融合育種是可以進行的，可以完成構(gòu)建新品種的杏鮑菇的目的。

參考文獻

[1]馮偉林，蔡為明，金群麗，等.杏鮑菇擔(dān)孢子交配型的鑒定分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22（1）：100-104.

[2]王愛仙.不同碳氮比培養(yǎng)料對杏鮑菇菌絲生長的影響[J].浙江食用菌，2010，18（4）：20-21.

[3]桂明英，王剛，郭永紅，等.食用菌育種技術(shù)的研究進展[J].中國食用菌，2006，25（5）：3-5.

[4]付曉燕，范黎.粗柄羊肚菌原生質(zhì)體制備及再生技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（5）：35-37.

[5]劉敏，李娟，周波，等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備與再生條件初探[J].生物技術(shù)，2005，15（1）：54-55.

[6]陳敏，蔣予箭，姚善涇，等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備技術(shù)的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：155-152.

[7]陳漱涢，曹衛(wèi)軍.幾種絲狀真菌原生質(zhì)體的形成與再生[J].真菌學(xué)報，1986，5（2）：177-123. [8]何強泰，張李楊.大型真菌原生質(zhì)體技術(shù)的研究進展[J].南京曉莊學(xué)院學(xué)報，2001，17（4）：47-50.

[9]劉玉霞，王謙，陳瑞玲，等.白靈菇原生質(zhì)體制備及再生的研究[J].食用菌，2009，（4）：24-25.

[10]金衛(wèi)根.高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體制備的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（4）：111-113.

[11]譚文輝，李燕萍，許洋.微生物原生質(zhì)體制備及再生的影響因素[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：263-265.

（責(zé)編：張長青）

2.3 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響 菌絲酶解一定時間，有活性的原生質(zhì)體產(chǎn)量會不斷增加，但是酶解時間過長，就會造成原生質(zhì)體長時間浸泡在酶液中導(dǎo)致細胞破裂，活性原生質(zhì)體數(shù)目下降。由圖3可以看到，酶解2.5 h的時候，活性原生質(zhì)體產(chǎn)量達到最高，濃度為4.7×106 個/mL。

2.4 pH值對原生質(zhì)體制備的影響 酶在不同pH值環(huán)境下活性不一樣，pH值會影響酶的作用效果；不僅如此，pH值還會影響細胞膜的穩(wěn)定性，過高或過低的pH值都會對細胞膜產(chǎn)生不利影響[10]。根據(jù)圖4得出，當(dāng)pH5.5的時候，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，濃度為4.87×106個/mL；pH接近中性時，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯下降。

2.5 溫度的選擇 酶解溫度不僅會影響酶的活力，也會影響原生質(zhì)體的活力，所以酶解溫度偏高或偏低都會對最后形成的原生質(zhì)體數(shù)量有一定影響。由圖5得出，溫度在30℃以下，原生質(zhì)體產(chǎn)量明顯低于30℃及以上兩個溫度，并且溫度為30℃時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，原生質(zhì)體濃度為4.1×106個/mL。說明在30℃時，此酶的活性高，杏鮑菇的原生質(zhì)體產(chǎn)量高。

2.6 穩(wěn)壓劑濃度的選擇 穩(wěn)壓劑的存在，不僅能保證原生質(zhì)體細胞膜內(nèi)外壓力的恒定，保證原生質(zhì)體不易破裂，還有可能會促進酶與底物的結(jié)合。由圖6可以得出，滲透壓穩(wěn)定劑濃度過高或者過低對原生質(zhì)體的產(chǎn)量影響較明顯。本研究中，甘露醇濃度為0.6mol/L時杏鮑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，濃度達到6.05×106個/mL。

2.7 菌齡的選擇 菌絲的培養(yǎng)時間對原生質(zhì)體的制備存在較大的影響，菌絲在不同的時期細胞壁結(jié)構(gòu)、菌體代謝水平和菌體活力都不一樣，不同菌在不同時期用于制備原生質(zhì)體產(chǎn)量也不一樣[11]。培養(yǎng)時間短，菌絲體產(chǎn)量低，不足夠酶解；而培養(yǎng)時間過長，則有可能導(dǎo)致菌絲老化難以被酶解。由圖7可以看到，杏鮑菇菌絲體培養(yǎng)5d后，制備的原生質(zhì)體數(shù)量最多，濃度達到6.10×106個/mL。

3 小結(jié)

通過以上單一變量的試驗表明，采用平板法培養(yǎng)菌絲5d，在pH5.5，用0.6mol/L的甘露醇作為穩(wěn)壓劑，2.0%濃度的單一溶壁酶條件下酶解菌絲2.5h，杏鮑菇的原生質(zhì)體制備效果最佳，其產(chǎn)量可以達到6.10×106個/mL。這一試驗表明對杏鮑菇進行細胞融合育種是可以進行的，可以完成構(gòu)建新品種的杏鮑菇的目的。

參考文獻

[1]馮偉林，蔡為明，金群麗，等.杏鮑菇擔(dān)孢子交配型的鑒定分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22（1）：100-104.

[2]王愛仙.不同碳氮比培養(yǎng)料對杏鮑菇菌絲生長的影響[J].浙江食用菌，2010，18（4）：20-21.

[3]桂明英，王剛，郭永紅，等.食用菌育種技術(shù)的研究進展[J].中國食用菌，2006，25（5）：3-5.

[4]付曉燕，范黎.粗柄羊肚菌原生質(zhì)體制備及再生技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16（5）：35-37.

[5]劉敏，李娟，周波，等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備與再生條件初探[J].生物技術(shù)，2005，15（1）：54-55.

[6]陳敏，蔣予箭，姚善涇，等.杏鮑菇原生質(zhì)體制備技術(shù)的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：155-152.

[7]陳漱涢，曹衛(wèi)軍.幾種絲狀真菌原生質(zhì)體的形成與再生[J].真菌學(xué)報，1986，5（2）：177-123. [8]何強泰，張李楊.大型真菌原生質(zhì)體技術(shù)的研究進展[J].南京曉莊學(xué)院學(xué)報，2001，17（4）：47-50.

[9]劉玉霞，王謙，陳瑞玲，等.白靈菇原生質(zhì)體制備及再生的研究[J].食用菌，2009，（4）：24-25.

[10]金衛(wèi)根.高大環(huán)柄菇原生質(zhì)體制備的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，21（4）：111-113.

[11]譚文輝，李燕萍，許洋.微生物原生質(zhì)體制備及再生的影響因素[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：263-265.

（責(zé)編：張長青）