紅籽鳶尾高頻離體再生條件的初步篩選

張永俠， 原海燕， 顧春筍， 黃蘇珍,①

〔1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院， 江蘇 南京 210095; 2. 江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

紅籽鳶尾(IrisfoetidissimaLinn.)為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(IrisLinn.)多年生草本植物，原產(chǎn)于西歐和非洲北部。該種的葉鞘呈深綠色劍形，蒴果飽滿且蒴果成熟開(kāi)裂后露出紅、橙黃和白等不同色澤的種子并一直垂掛到翌年春天，集觀花、觀葉和觀果為一體，觀賞價(jià)值較高。另外，該種還具有耐寒性好、在長(zhǎng)江中下游地區(qū)四季常綠、適應(yīng)性強(qiáng)及耐粗放管理等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)良的常綠地被植物。

鳶尾屬植物通常以種子和分株方式進(jìn)行繁殖，繁殖率較低，難以滿足生產(chǎn)需求[1-3]。雖然紅籽鳶尾的結(jié)實(shí)率相對(duì)較高，但由于種子休眠期較長(zhǎng)且休眠時(shí)間不等，使其發(fā)芽率低、出苗不整齊，自然繁殖系數(shù)僅為5～8，極大地限制了該種的推廣和應(yīng)用。

組織培養(yǎng)方法是解決鳶尾屬植物快速繁殖的有效途徑之一[4-6]，但關(guān)于紅籽鳶尾的組織培養(yǎng)研究還未見(jiàn)報(bào)道。作者以紅籽鳶尾莖尖為外植體，對(duì)其愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)以及生根培養(yǎng)基中的適宜激素組合進(jìn)行篩選，初步建立紅籽鳶尾的高效再生體系，為其種苗的規(guī)?；a(chǎn)、推廣應(yīng)用以及轉(zhuǎn)基因育種等工作奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試紅籽鳶尾于2010年引自法國(guó)，現(xiàn)定植于江蘇省·中國(guó)科學(xué)院植物研究所鳶尾屬植物種質(zhì)圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 紅籽鳶尾植株用清水沖洗，去掉根和葉，保留2 cm莖尖作為外植體。將外植體置于體積分?jǐn)?shù)10%洗滌液中浸泡10～15 min，流水沖洗干凈后吸干表面水分；在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡45 s后，經(jīng)無(wú)菌水浸泡并沖洗2次；再用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%HgCl2消毒10～12 min，無(wú)菌水再次沖洗5次，最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，備用。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 將已滅菌的外植體切成2 mm×2 mm×2 mm的小塊，分別接種于6組含不同質(zhì)量濃度2,4-D和6-BA的MS培養(yǎng)基(含30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂，pH 5.8)中， 并置于溫度(25±2) ℃ 、 光照時(shí)間12 h·d-1、光照度3 000 lx的條件下進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。其中，2,4-D質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg·L-1，6-BA質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2和0.3 mg·L-1。每處理5瓶，每瓶接種6個(gè)外植體，并設(shè)置3次重復(fù)。每天觀察并記錄在不同培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)狀況，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 在篩選出的最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2～3次后，將長(zhǎng)勢(shì)良好且一致的愈傷組織接種到5組含有不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基(含有30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂，pH 5.8)上，并置于溫度(25±2) ℃、光照時(shí)間12 h·d-1、光照度3 000 lx條件下進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。6-BA質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5和2.0 mg·L-1，NAA質(zhì)量濃度分別為0.2、0.3和0.5 mg·L-1。每處理5瓶，每瓶接種6塊愈傷組織，并設(shè)置3次重復(fù)。每天觀察并記錄在不同培養(yǎng)基上不定芽誘導(dǎo)以及愈傷組織褐化狀況， 30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率及愈傷組織褐化率。不定芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出不定芽的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100%；愈傷組織褐化率=(褐化的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù))×100%。

1.2.4 生根培養(yǎng)基篩選 選擇高3～5 cm且長(zhǎng)勢(shì)健壯的不定芽分別轉(zhuǎn)接于含0.2、0.5、1.0和1.5 mg·L-1NAA的MS和1/2MS培養(yǎng)基(含30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂，pH 5.8)上，并于溫度(25±2) ℃ 、光照時(shí)間12 h·d-1、光照度3 000 lx的條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)。每處理3瓶，每瓶接種10個(gè)不定芽，并設(shè)置3次重復(fù)。每天觀察并記錄不同培養(yǎng)基上不定芽的生根狀況，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的生根率；同時(shí)，觀察并統(tǒng)計(jì)根的顏色、數(shù)量和長(zhǎng)度，并根據(jù)組培苗生長(zhǎng)狀況和葉的發(fā)黃枯萎程度對(duì)組培苗長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行分級(jí)(分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí))。生根率=(生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽數(shù))×100%；

1.2.5 煉苗與移栽 將生根的組培苗放在室內(nèi)煉苗2～3 d，然后置于溫室內(nèi)煉苗2～3 d；選取生長(zhǎng)健壯的植株，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到裝有栽培基質(zhì)〔V(田土)∶V(泥炭)∶V(珍珠巖)∶V(河沙)=2∶1∶1∶1〕的穴盤(pán)里，澆透水并置于溫室內(nèi)培養(yǎng)。每天定時(shí)噴水，5周后統(tǒng)計(jì)組培苗成活率。成活率=(成活植株數(shù)/移栽植株數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用EXCEL 2007統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，紅籽鳶尾莖尖外植體接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7 d后出現(xiàn)膨大現(xiàn)象，10 d后陸續(xù)有淡綠色或黃色愈傷組織出現(xiàn)。表1結(jié)果表明：在添加1.5 mg·L-12,4-D和0.1 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基上，紅籽鳶尾愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)到77.27%，與其他5組培養(yǎng)基差異顯著(P<0.05)，愈傷組織的生長(zhǎng)狀況也最好，呈淡綠色或黃色且生長(zhǎng)旺盛。

表1 在添加不同激素組合的培養(yǎng)基上紅籽鳶尾莖尖愈傷組織誘導(dǎo)狀況比較

2.2 不同激素組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，紅籽鳶尾的愈傷組織在轉(zhuǎn)接到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上10 d左右開(kāi)始變綠，21 d左右出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，28 d后可看到明顯的不定芽。表2結(jié)果表明：除添加0.5 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基外，其余4組培養(yǎng)基上不定芽的誘導(dǎo)率都很高，均在68%以上，最高達(dá)到75.56%；愈傷組織褐化率卻較低，均低于15%；并且這4組培養(yǎng)基上不定芽的誘導(dǎo)率和愈傷組織的褐化率與前者均差異顯著(P<0.05)，但這4組培養(yǎng)基2個(gè)指標(biāo)間的差異不顯著。從表2還可見(jiàn)：培養(yǎng)基中6-BA添加量低于1.0 mg·L-1時(shí)，不定芽長(zhǎng)勢(shì)健壯；而6-BA添加量高于1.0 mg·L-1時(shí)，紅籽鳶尾不定芽生長(zhǎng)細(xì)密且長(zhǎng)勢(shì)較弱。 另外， 在6-BA添加量為1.0 mg·L-1時(shí)， 添加0.2或0.3 mg·L-1NAA，不定芽誘導(dǎo)率差異不顯著。

表2 在添加不同激素組合的培養(yǎng)基上紅籽鳶尾不定芽誘導(dǎo)率及愈傷組織褐化率比較

2.3 基本培養(yǎng)基類型和NAA添加量對(duì)不定芽生根的影響

由統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表3)可見(jiàn)：不論是以MS還是1/2MS為基本培養(yǎng)基，隨著NAA添加量的提高，紅籽鳶尾不定芽的生根率和生根質(zhì)量均逐漸下降。NAA添加量較高(1.0～1.5 mg·L-1)時(shí)，不定芽上萌出的不定根短小、數(shù)量多且較細(xì)密，對(duì)組培苗的生長(zhǎng)有一定的影響；當(dāng)NAA添加量為0.2 mg·L-1時(shí)，不定芽的生根率顯著高于其他處理組，生根數(shù)為3～6條，且根系粗壯。在NAA添加量相同的條件下，以MS為基本培養(yǎng)基，組培苗的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于以1/2MS為基本培養(yǎng)基。

表3 基本培養(yǎng)基類型及NAA添加量對(duì)紅籽鳶尾不定芽生根的影響

2.4 組培苗的成活率統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：經(jīng)培養(yǎng)室和溫室煉苗后，移栽到栽培基質(zhì)中的紅籽鳶尾組培苗的成活率較高，均達(dá)到95%以上。

3 討論和結(jié)論

研究結(jié)果表明：在MS培養(yǎng)基中添加0.1 mg·L-16-BA和1.5 mg·L-12,4-D對(duì)紅籽鳶尾莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)77.27%；并且愈傷組織的生長(zhǎng)狀況也最好，呈淡綠色或黃色且生長(zhǎng)旺盛。綜合考慮不定芽誘導(dǎo)率、愈傷組織褐化率及培養(yǎng)成本，確定紅籽鳶尾莖尖不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為添加1.0 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為72.22%；最適生根培養(yǎng)基為添加0.2 mg·L-1NAA的MS培養(yǎng)基，生根率達(dá)100.00%。

與其他研究者[2-3]有關(guān)鳶尾屬植物組織培養(yǎng)的研究結(jié)果相比，作者篩選出的紅籽鳶尾莖尖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率較高，這可能與外植體不同有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：6-BA添加量為1.0～2.0 mg·L-1，紅籽鳶尾莖尖不定芽誘導(dǎo)率都很高，均在68%以上；但當(dāng)6-BA添加量高于1.0 mg·L-1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率雖未明顯下降，但不定芽生長(zhǎng)不良。鳶尾屬植物的組培苗生根相對(duì)比較容易，作者篩選出的紅籽鳶尾組培苗的生根培養(yǎng)基配方與畢曉穎等[6]的篩選結(jié)果明顯不同，但與徐立軍等[7]的研究結(jié)果相似，表明鳶尾屬不同種類適宜的生根培養(yǎng)基有一定差異。

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