田迎，滕兆剛，盧光明，鄭玲

0 引言

近年來，納米材料在醫(yī)藥領域的研究越來越廣泛，如修飾后具有熒光或磁性性能的納米顆粒能夠用于細胞標記、示蹤、造影;裝載藥物的介孔納米材料可以實現(xiàn)藥物轉運及靶向治療［1－4］。與此同時，納米材料的生物安全性也受到關注，其大小與表面物化性質都是決定細胞毒性的重要因素［5－8］。納米材料的分散性對于細胞凋亡的研究還未見報道。本文通過制備2種分散性不同的介孔二氧化硅納米材料(mesoporous silica nanomaterials，MSNs)，初步探索其對人胚腎細胞系293T細胞吞噬以及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料MSN-1、MSN-2為本實驗室滕兆剛博士制備合成，人胚腎細胞系293T細胞購自ATCC(American type culture collection)細胞庫，DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清及胰酶購自美國GIBCO公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要方法

1.2.1 MSN-1、MSN-2的制備和表征MSN-1、MSN-2

分別參照文獻［9－10］的方法制備。MSN-1、MSN-2利用透射電鏡方法進行表征，加速電壓為200 kV。首先配制0.05 g/L納米粒的乙醇溶液，超聲分散均勻后，滴于覆蓋有膜的銅網(wǎng)上，真空干燥后，于Hitachi H-8100型透射電子顯微鏡下拍攝，觀察納米粒的尺寸及分散性。

1.2.2 細胞培養(yǎng)293T細胞于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每48h傳代1次。

1.2.3 透射電鏡觀察293T細胞對MSN-1、MSN-2的攝取待293T細胞匯合度達70%時，分別加入混合均勻的MSN-1、MSN-2，使其終濃度為100 μg/mL，孵育24 h，清洗消化，收集細胞，用2.5%戊二醛固定、1%鋨酸后固定1 h，丙酮脫水，Epon-812樹脂包埋，45～65℃聚合48h，半薄切片定位，70nm超薄切片，醋酸鈾—檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-1011型透射電鏡觀察細胞對材料的吞噬結果。

1.2.4 流式細胞儀分析MSN-1、MSN-2對293T細胞凋亡的影響將細胞接種于6孔板上，每孔細胞數(shù)量約5×105，待細胞貼壁且達到70%匯合度時，分別加入濃度為0(對照)、100、150、200和250 μg/mL的MSN-1、MSN-2，每個濃度設3個孔。培養(yǎng)箱孵育24 h，PBS洗滌收集細胞，分別加入500 μL的Binding buffer、5 μL的Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫避光反應15 min，流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。具體操作參照試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。定量結果以均數(shù)±標準差(x±s)表示。2組間的均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，組間方差不齊(以0.1作為檢驗水準進行Levene檢驗)時采用Satterthwaite校正t檢驗。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 透射電鏡觀察MSN-1和MSN-2的尺寸及分散性MSN-1、MSN-2制備后裝入容器，待沉淀后觀察，MSN-2均勻分散在溶液中，MSN-1見分層，見圖1a。進一步分析透射電鏡結果，2種納米粒呈球狀，尺寸均在100 nm左右;MSN-1顆粒之間有連接，見圖1b，MSN-2分散性較好，與圖1a結果一致，見圖1c。

2.2 人胚腎細胞系293T細胞吞噬納米粒MSN-1和MSN-2293T細胞培養(yǎng)狀態(tài)良好，見圖2a;通過透射電鏡觀察293T細胞對MSN-1和MSN-2這2種材料均有攝取，計數(shù)結果顯示大約10%的納米粒被細胞吞噬;因MSN-1顆粒之間有連接，進入細胞后成團聚狀，見圖2c;MSN-2顆粒在細胞中分散性也相對明顯，見圖2d。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果不同濃度梯度的MSN-1，MSN-2(0、100、150、200和250 μg/mL)與293T細胞共同孵育24 h，流式細胞儀檢測結果顯示與對照(0 μg/mL)濃度比較，100、150、200和250 μg/mL的MSN-1對293T細胞的影響差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);MSN-2組并未引起明顯的細胞凋亡反應，見圖3，表1。

表1 MSNs對293T細胞凋亡的影響(x±s，%)Table 1 The cell apoptosis of 293T impacted by the two MSNs(x±s，%)

圖1 靜置狀態(tài)與透射電鏡下觀察MSNs的分散性Figure 1 The dispersion of two MSNs by transmission electron microscopy and after precipitation

圖2 透射電鏡觀察人胚腎細胞系293T對2種MSNs的攝取Figure 2 The human embryonic kidney cell 293T and the phagocytosis to the two MSNs by transmission electron microscopy

圖3 流式細胞儀檢測不同濃度的MSNs影響細胞凋亡的結果Figure 3 The cell apoptosis results induced by MSNs with different concentration by flow cytometer

3 討論

由于介孔納米材料具有規(guī)則的孔徑結構和較大的表面積，有利于反應物的擴散，并能在孔道內(nèi)裝載藥物，從而實現(xiàn)疾病的靶向治療，在生物醫(yī)學等領域顯示出重要的應用前景［11－13］。隨著介孔材料研究的深入和應用的推廣，其生物安全性成為目前關注的熱點。介孔材料的大小、結構、分散性及表面性質等理化因素均有可能影響細胞骨架和細胞核的完整性與穩(wěn)定性，影響細胞某些生物學功能，導致細胞的凋亡反應［14－16］。

本文主要研究2種分散性不同的MSNs對人正常細胞系如人胚腎細胞系293T細胞的影響，考察其對細胞的吞噬和凋亡，為接下來的載藥治療提供研究基礎。透射電鏡的結果表明，2種MSNs的分散性不同，仍有大約10%的材料進入細胞，被溶酶體包被;同時分散性也影響材料在細胞中的狀態(tài)，分散性好的材料進入細胞后仍有良好的分散性，顆粒狀明顯，分散性差的材料進入細胞后成團聚狀態(tài)。凋亡是一種程序性的、正常的細胞死亡，本實驗利用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測不同濃度梯度下2種MSNs對293T細胞凋亡的影響，結果顯示分散性不佳的材料MSN-1隨著孵育濃度的增加，引起293T細胞的凋亡，分析原因可能由于材料進入細胞后成團聚狀態(tài)，導致自噬泡局部濃度過高，與溶酶體結合后，降解胞內(nèi)大分子或細胞器，過度的自噬引起細胞凋亡［17］。而MSN-2分散性較好，并未引起明顯的凋亡反應，提示此材料在胞內(nèi)濃度達到250 μg/mL時不會引起細胞明顯的毒性反應。

總之，闡明納米材料的生物安全性，并合理設計和優(yōu)化材料的功能結構才能拓展其在生物、醫(yī)藥方面的研究，實現(xiàn)向臨床應用等跨學科領域的轉換，顯示其重要的價值。

［1］Tang N，Du G，Wang N，et al.Improving penetration in tumors with nanoassemblies of phospholipids and doxorubicin［J］.J Natl Cancer Inst，2007，99(13):1004-1015.

［2］Deshpande N，Needles A，Willmann JK.Molecular ultrasound imaging:current status and future directions［J］.Clin Radiol，2010，65(7):567-581.

［3］Ke H，Wang J，Dai Z，et al.Gold-nanoshelled microcapsules:a theranostic agent for ultrasound contrast imaging and photothermal therapy［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2011，50(13):3017-3021.

［4］朱役，賈紹昌，蔡凱，等.靶向血管內(nèi)皮生長因子的納米顆粒制備及其對大腸癌細胞株SW620的作用［J］.醫(yī)學研究生學報，2011，24(10):1019-1022.

［5］Song Y，Li X，Du X.Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion，pulmonary fibrosis and granuloma［J］.Eur Respir J，2009，34(3):559-567.

［6］Lewinski N，Colvin V，Drezek R.Cytotoxicity of nanoparticles［J］.Small，2008，4(1):26-49.

［7］Yang Z，Zhang Y，Yang Y，et al.Pharmacological and toxicological target organelles and safe use of single-walled Carbon nanotubes as drug carriers in treating Alzheimer disease［J］.Nanomedicine，2010，6(3):427-441.

［8］Medina C，Santos-Martinez MJ，Radomski A，et al.Nanoparticles:pharmacological and toxicological significance［J］.Br J Pharmacol，2007，150(5):552-558.

［9］Lu F，Wu SH，Hung Y，et al.Size effect on cell uptake in wellsuspended，uniform mesoporous silica nanoparticles［J］.Small，2009，5(12):1408-1413.

［10］Teng ZG，Han YD，Li J，et al.Preparation of hollow mesoporous silica spheres by a sol-gel/emulsion approach［J］.Microporous Mesoporous Mater，2010，127(1-2):67-72.

［11］Liu Y，Wang H.Nanomedicine:Nanotechnology tackles tumours［J］.Nat Nanotechnol，2007，2(1):20-21.

［12］孫加司，陳思嬌，史記，等.納米金檢測單核苷酸多態(tài)性的應用進展［J］.醫(yī)學研究生學報，2012，25(1):85-88.

［13］Amirfazli A.Nanomedicine:magnetic nanoparticles hit the target［J］.Nat Nanotechnol，2007，2(8):467-468.

［14］Elder A，Yang H，Gwiazda R，et al.Testing nanomaterials of unknown toxicity:an example based on platinum nanoparticles of different shapes［J］.Adv Mater，2007，19(20):3124-3129.

［15］Unfried K，Albrecht C，Klotz LO，et al.Cellular responses to nanoparticles:target structures and mechanisms［J］.Nanotoxicology，2007，1(1):52-71.

［16］Faraji AH，Wipf P.Nanoparticles in cellular drug delivery［J］.Bioorg Med Chem，2009，17(8):2950-2962.

［17］Okada H，Mark TW.Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells［J］.Nat Rev Cancer，2004，4(8):592-603.