宋程光+楊鑫+閔連秋+等

宋程光1 楊 鑫1 閔連秋2 劉長喜1

1.中國醫(yī)科大學(xué)本溪中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧本溪 117000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 121001

[摘要] 目的 探討原花青素（PC）對2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）表達(dá)的影響。 方法 75只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，2型糖尿病合并腦缺血組，PC低、中、高劑量組，每組15只。制作2型糖尿病大鼠局灶性腦缺血模型，PC組在建立2型糖尿病模型后給予灌胃，1次/24 h，連續(xù)1周，于大腦中動(dòng)脈缺血術(shù)前1 h再灌胃1次。PC低、中、高劑量組分別以PC粉劑50、100、200 mg/（kg·次）灌胃。進(jìn)行神經(jīng)功能評分，免疫組化SABC染色法對STAT1蛋白進(jìn)行定量分析，統(tǒng)計(jì)大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)每高倍鏡視野STAT1蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較，2型糖尿病合并腦缺血組的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯增高[0分比（3.42±1.00）分]，缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)減少[（102.10±4.62）個(gè)/HP比（56.60±6.15）個(gè)/HP]，缺血側(cè)皮質(zhì)STAT1陽性細(xì)胞數(shù)增多[（4.10±1.26）個(gè)/HP比（20.13±1.36）個(gè)/HP]，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）；與2型糖尿病局灶性腦缺血組相比，PC低、中和高劑量組的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯減少[（2.83±0.83）、（1.83±0.58）、（1.42±0.51）分]、缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)增多[（82.40±2.88）、（92.40±4.28）、（95.20±5.26）個(gè)/HP]、缺血側(cè)皮質(zhì)STAT1的表達(dá)均明顯減少[（17.25±0.99）、（13.67±1.88）、（12.92±1.74）個(gè)/HP]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；PC中、高劑量組的作用比PC低劑量組更明顯（P < 0.01），但PC中、高劑量組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 原花青素可能通過降低STAT1蛋白的表達(dá)，影響Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而抑制細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)功能缺損，達(dá)到對2型糖尿病合并缺血性腦血管病的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病；腦缺血；原花青素；轉(zhuǎn)錄激活因子1

[中圖分類號(hào)] R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）03（c）-0033-05

The effect of procyanidin on expression of STAT1 in SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia

SONG Chengguang1 YANG Xin1 MIN Lianqiu2 LIU Changxi1

1.Department of Neurology， Benxi Central Hospital of China Medical University， Liaoning Province， Benxi 117000， China； 2.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University， Liaoning Province Jinzhou 121001， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of procyanidin （PC） on the expression of signal transducers and activators of transcription （STAT1） in SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia. Methods 75 SD rats were randomly divided in to sham operation group， SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia group， PC low-dose group， PC middle-dose group， and PC high-dose group， with 15 rats in each group. Set up type 2 diabetes mellitus-MCAO model， rats of the PC groups were treated with intragastric administration of PC after creation of the diabetes model， once a day for 1 week， and at 1 hour before the MCAO surgery， rats were treated with intragastric administration once again. The doses of PC for low-dose， mid-dose and high-dose groups were 50， 100， 200 mg/（kg·time）. The neurological function was evaluated， the STAT1 protein was quantitative analyzed by immunohistochemistry methods， and the neurons of the ischemical lateral hippocampus of high magnification every vision in ischemic penumbra were counted. Results Compared with sham group， neurologic impairment score of SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia group increased [0 score vs （3.42±1.00） scores]， the neurons of ischemical lateral hippocampus decreased [（102.10±4.62）/HP vs （56.60±6.15）/HP]， the expression of STAT1 increased [（4.10±1.26）/HP vs （20.13±1.36）/HP]， the differents were statistically significant （P < 0.01）； compared with SD rats with type 2 diabetes mellitus and focal cerebral ischemia group， neurologic impairment score decreased [（2.83±0.83）， （1.83±0.58）， （1.42±0.51） scores]， the neurons of ischemical lateral brain increased [（82.40±2.88）， （92.40±4.28）， （95.20±5.26）/HP]， the expression of STAT1 decreased [（17.25±0.99）， （13.67±1.88）， （12.92±1.74）/HP]， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）， whereby the mid-dose and high-dose groups showed a more substantial decrease compared with （P < 0.01）， but with no statistically significant difference in the two groups （P > 0.05）. Conclusion These results indicate that PC has a neuroprotective effect on type 2 diabetes mellitus with focal cerebral ischemia； this may be through decreasing the expression of STAT1， which influences the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription （JAK/STAT） pathway that may inhibit apoptosis to relieve neurological impairment.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus； Cerebral ischemia； Procyanidin； STAT1

糖尿病是缺血性腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其發(fā)生腦梗死的危險(xiǎn)性是普通人的2～3倍[1]。腦梗死是2型糖尿病最常見的大血管并發(fā)癥，也是2型糖尿病患者最常見的死亡原因，其發(fā)病后的癥狀重、預(yù)后差、病死率高。本研究通過檢測神經(jīng)行為學(xué)評分，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)以及STAT1的表達(dá)情況來探討原花青素（PC）對2型糖尿病局灶性腦缺血的保護(hù)作用。

Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）途徑是眾多細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后激活JAK，進(jìn)一步激活STAT，再誘導(dǎo)其下游的目的基因表達(dá)。近來研究表明，JAK/STAT途徑是人體內(nèi)生理和病理反應(yīng)的共同傳導(dǎo)通路之一，該途徑與多種疾病發(fā)病及防治密切相關(guān)[2-4]。腦缺血時(shí)能釋放大量細(xì)胞因子和生長因子，這些因子能夠激活JAK/STAT信號(hào)通路，現(xiàn)已證實(shí)腦缺血可以誘導(dǎo)STAT1蛋白表達(dá)增加[5]，使JAK/STAT信號(hào)通路激活。STAT1能抑制細(xì)胞生長，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的信號(hào)傳導(dǎo)，并能負(fù)性調(diào)節(jié)cMyc啟動(dòng)子的表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)[6]。

本實(shí)驗(yàn)研究PC對2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦組織中STAT1表達(dá)的影響，來探討原花青素對2型糖尿病大鼠局灶性腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；PC由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供（批號(hào)：6050804）。Rabbit Anti-STAT1蛋白試劑盒、生物素化二抗、DAB濃縮顯色液、DAB稀釋液均由武漢博士德生物試劑公司提供。膽酸鈉、膽固醇由鄭州利偉生物實(shí)業(yè)有限公司提供，鏈脲佐菌素（STZ）由廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

SD大鼠75只，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組，2型糖尿病合并腦缺血組，PC低、中、高劑量組，每組各15只。PC組在建立2型糖尿病模型后給予灌胃，1次/24 h，連續(xù)1周，于大腦中動(dòng)脈缺血（middle cerebral arteryocclusion，MCAO）術(shù)前1 h再灌胃1次。PC低、中、高劑量組分別以PC粉劑50、100、200 mg/（kg·次），蒸餾水配制成懸浮液灌胃。

1.2.2 模型制作

各組均先喂以高脂高糖飼料（10%煉豬油，2.5%膽固醇，20%蔗糖，2%膽酸鈉，65.5%普通飼料[7]）4周，誘發(fā)出胰島素抵抗，然后以鏈脲佐菌素（STZ）小劑量（25 mg/kg）腹腔注射1次，穩(wěn)定3 d后，測定大鼠尾尖血血糖，空腹血糖> 16.7 mmol/L的大鼠判定為2型糖尿病大鼠。

以線栓法制作MCAO模型[8-9]，大鼠用10%的水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉后，暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動(dòng)脈（ECA）分叉部，距CCA末端約5 mm處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國產(chǎn)尼龍線（直徑0.235 mm，長6 cm）插入，以頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算進(jìn)線深度為（18.0±0.5） mm，至大腦中動(dòng)脈起始部以完全阻斷血供。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)左側(cè)Horner征。排除有蛛網(wǎng)膜下腔出血者。假手術(shù)組除不插入線栓外，其他操作步驟同上。手術(shù)過程中，用加熱墊和燈泡保持肛溫在37.0～37.5℃。

1.2.3 檢測指標(biāo)

1.2.3.1 神經(jīng)功能缺損評分 MCAO術(shù)后24 h采用Bederson[10]6級(jí)5分評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評估，5級(jí)0分：正常（無功能障礙）；4級(jí)1分：對側(cè)上肢不能完全伸展；3級(jí)2分：向?qū)?cè)推時(shí)抵抗力下降；2級(jí)3分：提尾時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；1級(jí)4分：自動(dòng)轉(zhuǎn)圈；0級(jí)5分：無自發(fā)性活動(dòng)伴意識(shí)障礙。

1.2.3.2 HE染色 MCAO術(shù)后24 h，大鼠以10%水合氯醛（0.3 mL/100 mg）腹腔注射麻醉，打開頸部，暴露頸右總動(dòng)脈，插管，先輸注生理鹽水約50 mL，然后輸注4%多聚甲醛約50 mL，斷頭取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死中心（即最大層面），常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，制成4～6 μm厚的切片，附片，行蘇木精-伊紅（HE）染色：60℃烤箱過夜，二甲苯脫蠟后逐級(jí)酒精浸水，蘇木精浸染，1%鹽酸酒精分色，自來水漂洗，蒸餾水返藍(lán)30 min，鏡檢使細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，其余結(jié)構(gòu)基本無色。伊紅染液浸染后蒸餾水洗，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。觀察并計(jì)數(shù)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞。

1.2.3.3 免疫組化法 采用免疫組化法檢測缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1的表達(dá)，MCAO術(shù)后24 h，大鼠取腦步驟同HE染色，取雙側(cè)大腦冠狀位距嗅球尖端6～11 mm的腦組織塊，放入4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定24 h，常規(guī)梯度脫水、透明、石蠟包埋。從冠狀面中1/3層面開始留取切片，厚度5 μm，連續(xù)切片，切片貼附于經(jīng)APES處理的載玻片上，備用。用免疫組化法測定，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)行為學(xué)評分情況

與假手術(shù)組比較，2型糖尿病合并腦缺血組的神經(jīng)行為學(xué)評分明顯增高，PC各劑量組均能改善2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，其中PC中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC中、高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評分情況（分，x±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P < 0.01；與2型糖尿病腦缺血組比較，■P < 0.05，*P < 0.01；與PC低劑量組比較，#P < 0.05；PC：原花青素

2.2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)

PC各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)均明顯增多，其中PC中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC中、高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

表2 原花青素對各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

（個(gè)/HP，x±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P < 0.01；與2型糖尿病腦缺血組比較，*P < 0.01；與PC低劑量組比較，#P < 0.01；PC：原花青素

2.3 不同劑量PC對2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)STAT1陽性細(xì)胞表達(dá)率的影響

PC各組均能減少2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠腦組織中STAT1的含量，其中PC中、高劑量組效果比低劑量組更明顯，但PC中、高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3、圖1。

表3 原花青素對各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

及轉(zhuǎn)錄激活因子1陽性細(xì)胞表達(dá)率的影響（個(gè)/HP，x±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P < 0.01；與2型糖尿病腦缺血組比較，*P < 0.01；與PC低劑量組比較，#P < 0.01；PC：原花青素；STAT1：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1

A：假手術(shù)組；B：2型糖尿病合并腦缺血組；C：PC低劑量組；D：PC中劑量組；E：PC高劑量組

圖1 原花青素各組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

及轉(zhuǎn)錄激活因子1陽性細(xì)胞表達(dá)（SABC×400）

3討論

糖尿病對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響隨著此類患者的增多越來越受到人們的重視。糖尿病除了引起周圍神經(jīng)病變外，還表現(xiàn)出腦血管病發(fā)病率升高，糖尿病患者可能會(huì)合并其他并發(fā)癥，如高血壓、高脂血癥、自主神經(jīng)病、動(dòng)脈粥樣硬化的加速、血小板黏附和聚集能力升高、紅細(xì)胞變形能力降低、纖溶活性受損、血黏度高、腦實(shí)質(zhì)內(nèi)增殖性小血管病等，而且糖尿病缺血性卒中時(shí)可以有應(yīng)激性高血糖的產(chǎn)生，以上因素都加重缺血性腦損傷。

JAK/STAT通路是一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它的一個(gè)十分重要的作用就是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)。該途徑是一種比較簡單的轉(zhuǎn)錄化轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，不需要第二信使，其通過穿膜受體將細(xì)胞外多肽信號(hào)信息直接傳送到核內(nèi)的靶基因啟動(dòng)子，進(jìn)而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子的作用[11-13]。

PC具有降低毛細(xì)血管通透性、抗氧化的藥理作用[14-15]，其含有大量的活性酚羥基，這種化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有很強(qiáng)的清除各種活性氧自由基及抗氧化的能力。已有研究證實(shí)原花青素可通過清除缺血局部血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧自由基和抗氧化作用而應(yīng)用于治療和預(yù)防心肌缺血-再灌注損傷[16]，從藥理機(jī)制和腦血管病發(fā)病機(jī)制上看，PC對缺血性腦血管病應(yīng)有較好的作用。

近來有研究認(rèn)為STAT1有促進(jìn)凋亡的作用[17-19]。Takagi等[17]將小鼠STAT1基因敲除，制備STAT1基因缺陷小鼠，發(fā)現(xiàn)這種小鼠有抗缺血能力，表現(xiàn)為腦梗死面積明顯小于野生型小鼠，并且TUNEL陽性細(xì)胞顯著減少，神經(jīng)功能缺損也明顯減輕。為了探索STAT1基因缺陷小鼠抗缺血損傷的具體機(jī)制，筆者發(fā)現(xiàn)再灌注2 h后Akt絲氨酸473位點(diǎn)磷酸化較野生型小鼠明顯，而缺血誘導(dǎo)的c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）磷酸化在兩型小鼠之間的差異并不明顯，提示STAT1可能具有調(diào)節(jié)Akt活化的作用。此外，STAT1基因缺陷小鼠半光氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活化明顯低于野生型小鼠。Stephanou等[20]報(bào)道STAT1可以降低Bcl-2和Bcl-x的表達(dá)，而Bcl-2和Bcl-x是腦缺血再灌注損傷中很重要的抗凋亡基因，提示了在腦缺血損害過程中STATl的促凋亡作用。腦缺血能誘導(dǎo)磷酸化STAT1蛋白活化及核轉(zhuǎn)位，它們通過調(diào)節(jié)與凋亡和細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白Caspase-3的轉(zhuǎn)錄與磷酸化參與了缺血性腦損傷的過程。

在本研究中，2型糖尿病局灶性腦缺血組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多（P < 0.01），說明STAT1可能在2型糖尿病合并腦缺血時(shí)起到重要作用，推測其機(jī)制可能為2型糖尿病合并腦缺血時(shí)能引起大量細(xì)胞因子和生長因子的釋放，誘導(dǎo)磷酸化STAT1蛋白活化及核轉(zhuǎn)位，激活JAK/STAT1信號(hào)通路，它們能通過調(diào)節(jié)與凋亡和細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白Caspase-3的轉(zhuǎn)錄與磷酸化和其他途徑參與了缺血性腦損傷的過程，發(fā)揮了其促凋亡作用[21]。PC各組均能使2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)STAT1表達(dá)下調(diào)，其中PC中、高劑量組效果更明顯。推測PC可能通過抑制STAT1的表達(dá)而起到抑制JAK/STAT1通路，最終抑制了其促凋亡作用，從而起到了對2型糖尿病局灶性腦缺血大鼠的保護(hù)作用。

由于動(dòng)物和人體有巨大的差異且缺血機(jī)制復(fù)雜，可能阻斷單一環(huán)節(jié)的藥物都不一定奏效[22]。因此對PC的進(jìn)一步研究，將為治療糖尿病合并腦梗死提供更為可靠的理論依據(jù)。

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[21] 劉冬云，侯云生，王天軼，等.JAK/STAT信號(hào)通路在大鼠缺血再灌注心肌損傷中的表達(dá)[J].臨床誤診誤治，2012， 25（5）：87-89.

[22] 王擁軍.從缺血損害的分子機(jī)制到未來神經(jīng)保護(hù)劑的發(fā)展方向[J].中華老年心腦血管病雜志，2001，3（4）：219-220.

（收稿日期：2013-12-16 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2013-12-16 本文編輯：任 念）

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（收稿日期：2013-12-16 本文編輯：任 念）