微生物吸光值法定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

2014-04-10 01:52:20陳杰張振遠(yuǎn)

科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2014年12期

陳杰+++張振遠(yuǎn)

摘要：通過(guò)對(duì)鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供的巴氏芽孢桿菌的培養(yǎng)，分別取相同菌量1ml菌懸液（OD600=1.0440），按相應(yīng)體積倍數(shù)稀釋后，測(cè)定各OD600值。數(shù)據(jù)的擬合發(fā)現(xiàn)，全部稀釋倍數(shù)乘冪關(guān)系擬合線擬合度不高，OD600值大于1或小于0.2時(shí)，越靠近坐標(biāo)軸，數(shù)據(jù)越失真，誤差越大。截取0.2～1.0之間的OD600值，擬合乘冪曲線為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976），應(yīng)用簡(jiǎn)單倍數(shù)關(guān)系y=1.044/x換算，兩者誤差都維持在5%之內(nèi)。OD600值在0.2～1.0之間運(yùn)用簡(jiǎn)單倍數(shù)關(guān)系換算準(zhǔn)確、快捷。

關(guān)鍵詞：菌量；快捷；最優(yōu)區(qū)間；倍數(shù)關(guān)系

1 引言

微生物在人類(lèi)生產(chǎn)生活中體現(xiàn)的特殊優(yōu)勢(shì)早已出現(xiàn)，如污水治理中重金屬離子的細(xì)菌吸附[1]、礦業(yè)工程的生物浸出[2]、巖土工程的生物固化[3-4]等等，微生物已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

在研究微生物的過(guò)程中，對(duì)微生物量的測(cè)定是必須的一個(gè)過(guò)程。測(cè)定微生物生長(zhǎng)的方法很多，可分為直接法和間接法兩大類(lèi)。直接法有粗放的測(cè)體積法（在刻度離心管中測(cè)沉降值）和精確的稱(chēng)干重法。間接法有比濁法和生理指標(biāo)法[5]。比濁法是實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常使用的一種方法，用分光光度計(jì)選定一定波長(zhǎng)（450nm～650nm），對(duì)微生物懸浮液進(jìn)行吸光度的測(cè)定[6]。比濁法適用范圍廣，測(cè)量值在一定的區(qū)間內(nèi)比較準(zhǔn)確、可靠[7]。

采用比濁法測(cè)定的OD值，與細(xì)菌的濃度在一定范圍內(nèi)是呈現(xiàn)著正比例的關(guān)系[8]。實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)常會(huì)遇到菌懸液稀釋的問(wèn)題，稀釋后的菌懸液OD值和初始的懸液OD值的關(guān)系卻也不是簡(jiǎn)單的倍數(shù)關(guān)系，而是呈現(xiàn)出一種乘冪關(guān)系[9]。較高的初始OD值需要稀釋且較低的OD值需濃縮后才能用于測(cè)定，而不能直接測(cè)定以防止檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確性，出現(xiàn)較大的誤差甚至是錯(cuò)誤[10]。

為此，準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌菌液濃度，了解在一定OD值范圍內(nèi)，稀釋倍數(shù)與稀釋OD值的關(guān)系及準(zhǔn)確快速進(jìn)行菌量比較的方法在對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)換算方面有著一定的意義。

2 材料和方法

2.1 儀器設(shè)備

AL 104電子天平、VB-40高壓滅菌鍋（德國(guó)systec）、SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)、小容量恒溫高速培養(yǎng)振蕩器搖床（SHP-200D）、微量冷凍離心機(jī)（5415R Germany）、蛋白核酸測(cè)定儀（biophotometer eppendorf Germany）、pHS-3C酸度計(jì)、eppendorf移液槍

2.2 菌種

保存在超低溫冰箱的巴氏芽孢桿菌單一菌株，菌種由鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供。

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

培養(yǎng)基成分為酵母提取物20g/L、氯化銨10g/L及去離子水，pH調(diào)至8.5，過(guò)濾滅菌器經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，放置潔凈工作臺(tái)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)濾滅菌。每100ml培養(yǎng)液放置在250ml錐形瓶中，母液（OD600值1.500）1：100接種，放置搖床中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r/min。

2.4 細(xì)菌懸液制備

放置搖床8h后，取出菌液。取30支2ml的離心管，1000μL移液槍準(zhǔn)確移取菌液，每離心管1ml。30支離心管分A、B兩批，每批15支，分別放置于離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速10000rpm，溫度4℃，離心10分鐘，離心后吸除上清液，用2ml生理鹽水沖洗細(xì)菌，再次離心。重復(fù)沖洗離心一次。分別將離心之后的細(xì)菌用生理鹽水稀釋成0.3ml、0.4ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml、5ml、7.5ml、10ml、12.5ml。

2.5 OD600值的測(cè)定

以生理鹽水為空白樣，用蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定各樣品OD600值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)如表1。

截取OD600值0.2～1的數(shù)據(jù)，乘冪關(guān)系擬合圖為圖2。

圖1對(duì)于全部稀釋倍數(shù)（0.3～12.5），用乘冪關(guān)系擬合后，擬合程度不高（R2=0.9258<0.95），在0

圖2截取OD600值0.2～1的數(shù)據(jù)，乘冪關(guān)系擬合，R2=0.9976。原始數(shù)據(jù)帶入擬合公式y(tǒng)=1.0764x-1.0115（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)），分別得出y1～y5及所對(duì)應(yīng)的誤差δ1～δ5（如表2）。最大誤差為δ4.5=4.10%，最小誤差為δ3=0.56%，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的換算具有較高的準(zhǔn)確性，且能達(dá)到99.44%。

實(shí)際的菌液稀釋換算中簡(jiǎn)單的倍數(shù)關(guān)系更加的快捷易于把握，用公式y(tǒng)=1.044x-1（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)）換算，分別得出y'1～y'5及所對(duì)應(yīng)的誤差δ'1～δ'5（如表2）。最大誤差為δ'1.5=5.33%，最小誤差為δ'4=0.80%，在0.2

兩次換算結(jié)果數(shù)據(jù)如表2。

從表2中對(duì)比得出：OD600值在1～0.2區(qū)間上，兩種換算關(guān)系結(jié)果的誤差維持在5%的水平，具有較高的精確度，而超過(guò)這一范圍即OD600值在大于1或者小于0.2時(shí)，越靠近坐標(biāo)軸任意兩種換算的結(jié)果誤差就越大，失去了換算的指導(dǎo)意義。菌懸液稀釋曲線呈現(xiàn)的是乘冪關(guān)系和徐風(fēng)[9]等人的結(jié)論一致。簡(jiǎn)單的倍數(shù)關(guān)系曲線更易于換算和把握，與陶海靜[11]的結(jié)論相似。實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，在特定的范圍內(nèi)（OD600值在1～0.2之間），將高濃度的菌懸液稀釋到此區(qū)間，用簡(jiǎn)單的倍數(shù)換算就可以得到較為精確的換算值，方便于不同菌懸液菌量的比較。

4 結(jié)論

（1）菌懸液稀釋倍數(shù)與稀釋OD600值不是呈現(xiàn)出簡(jiǎn)單的倍數(shù)關(guān)系，而是區(qū)間性的乘冪關(guān)系或是區(qū)間性的簡(jiǎn)單倍數(shù)關(guān)系。

（2）此菌懸液稀釋值處在0.2～1.0之間，液稀釋倍數(shù)與稀釋OD600值的乘冪關(guān)系公式為y=1.0764x-1.0115（R2=0.9976）（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)），同樣在此區(qū)間內(nèi)滿(mǎn)足簡(jiǎn)單倍數(shù)關(guān)系y = 1.044/x（y為稀釋后菌液的OD600值，x為稀釋倍數(shù)）。

（3）實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定菌懸液OD600值應(yīng)處在0.2～1.0之間，應(yīng)用簡(jiǎn)單的倍數(shù)關(guān)系換算，準(zhǔn)確度達(dá)到95%，提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及比較換算的快捷性。

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*作者簡(jiǎn)介：陳杰（1989，10-），男，湖南華容人，南華大學(xué)核資源工程學(xué)院采礦工程碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸飵r土工程。endprint