陳夢婷 張順 蔡挺

●論 著

寧波市第二醫(yī)院住院患者產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性及基因型研究

陳夢婷 張順 蔡挺

目的 了解寧波市第二醫(yī)院住院患者病原菌培養(yǎng)中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌的耐藥情況及ESBLs基因分布情況。方法 收集2013-12—2014-05病原菌培養(yǎng)中分離的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌并分析耐藥結果，以PCR法擴增ESBLs耐藥基因并測序分析。結果 75株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林完全耐藥，對第三代頭孢菌素、喹諾酮類、氨基糖苷類藥物耐藥率較高，多重耐藥問題嚴重。PCR擴增陽性基因包括TEM、CTX-M-9組、CTX-M-1組、OXA-1組、SHV、OXA-10組，檢出率分別為85．33%（64株）、81．33%（61株）、49．33%（37株）、10．67%（8株）、5．33%（4株）、4．00%（3株）。64株TEM基因均為TEM-1亞型。CTX-M基因中CTX-M-14、CTX-M-55檢出率最高，分別為61．33%（46株）、29．33%（22株），還檢出較少基因亞型CTX-M-3、CTX-M-15、CTX-M-24、CTX-M-27、CTX-M-65、CTX-M-69、CTX-M-79。8株OXA-1組基因均為OXA-1亞型，4株SHV基因均為SHV-12亞型，3株OXA-10基因均為OXA-10亞型。結論 寧波市第二醫(yī)院病原菌培養(yǎng)中分離的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥情況較嚴重；ESBLs基因型以CTX-M-14最常見。

大腸埃希菌 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶 耐藥性 基因型

1 材料和方法

1.1 菌株來源 75株大腸埃希菌（不包括來自同一患者的重復分離菌株）分離自寧波市第二醫(yī)院2013-12—2014-05臨床各科室送檢的住院患者標本，標本包括痰液、尿液、血液、分泌物等。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、ATCC35218均購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 細菌鑒定、藥敏試驗及ESBLs表型檢測 使用法國生物梅里埃公司VitekⅡ全自動細菌鑒定儀及配套的革蘭陰性菌鑒定卡對菌株進行鑒定，以配套的藥敏卡行藥敏試驗及ESBLs檢測。為便于統(tǒng)計，“中介”結果納入“耐藥”處理。

1.3 細菌質(zhì)粒DNA提取 使用Omega質(zhì)粒小提試劑盒（美國Omega公司產(chǎn)品）進行質(zhì)粒提取。

1.4 PCR擴增 根據(jù)GenBank上ESBLs基因的保守序列，使用Oligo7.0軟件設計引物，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列及擴增片段長度見表1。25μl PCR反應體系：模板 DNA 10～100ng，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，上下游引物10μmol/L各1μl，Taq DNA聚合酶1U，ddH2O 17.3μl。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，不同引物按表1所示溫度退火30s，72℃延伸50s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物行1.00%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)上成像。

1.5 基因測序 PCR產(chǎn)物送深圳華大基因技術服務有限公司進行DNA測序，測序結果用NCBI上的BLAST Search進行比對分析。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果 產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌對氨芐西林100.00%耐藥，對第三代頭孢菌素如頭孢曲松、頭孢他啶耐藥率分別為97.33%和56.00%，對新的第四代頭孢菌素如頭孢吡肟也有34.67%的耐藥率。對于常用喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率較高，分別為81.33%和80.00%，常用氨基糖苷類藥物如慶大霉素、妥布霉素分別有54.67%和58.67%的耐藥率。所檢菌株中只有1株對碳青霉烯類藥物厄他培南耐藥，耐藥率1.33%。75株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對20種常用抗生素耐藥情況見表2。

2.2 基因型分析 對75株產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌進行耐藥基因PCR擴增，部分結果見圖1。共有74株檢出ESBLs基因，檢出率98.67%。其中TEM、CTX-M-9組基因檢出率最高，分別為64株（85.33%）和61株（81.33%）。另外CTX-M-1組檢出37株（49.33%），OXA-1組檢出8株（10.67%），SHV檢出4株（5.33%），OXA-10組檢出3株（4.00%），其余基因未檢出。

表1 引物序列及擴增片段長度

表2 75株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥性

圖1 部分基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖（M：DNA Marker；1～3：檢測菌株；P：陽性對照；N：陰性對照）

耐藥基因測序后經(jīng)BLAST Search比對，所有64例TEM基因均為TEM-1亞型。37例CTX-M-1組基因中CTX-M-55為主要基因亞型，共檢出22株，檢出率29.33%；CTX-M-15亞型檢出7株（9.33%）；檢出少量CTX-M-3、CTX-M-69、CTX-M-79基因亞型。61例CTX-M-9組基因中CTX-M-14亞型檢出率最高，檢出46株（61.33%）；CTX-M-65亞型檢出9株（12.00%）；檢出少量 CTX-M-27、CTX-M-24基因亞型。8株（10.67%）OXA-1組基因均為OXA-1基因亞型，4株（5.33%）SHV基因均為SHV-12亞型，3株（4.00%）OXA-10組基因均為OXA-10基因亞型，見表3。

3 討論

大腸埃希菌是臨床分離最常見的菌株之一，2012年中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CHINET）資料顯示，大腸埃希菌在所有臨床菌株分離中居首位，占27.00%以上[2-3]。近年來，由于抗生素的不斷使用，尤其是第三代頭孢菌素的不合理使用，大腸埃希菌耐藥機制在抗生素選擇性壓力下不斷發(fā)展，其中最重要的就是產(chǎn)生ESBLs。該酶主要定位于質(zhì)粒，可以在同種及不同種菌株間傳播；且這一耐藥質(zhì)粒常攜帶對喹諾酮類、氨基糖苷類等抗生素耐藥的基因，表現(xiàn)為多重耐藥，給臨床治療帶來眾多問題，導致患者病死率增高、住院時間延長、治療費用上升、治療選擇性越來越狹窄等。

表3 74株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥基因擴增及測序結果

本研究中，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林耐藥嚴重，均在95.00%以上，對第三代頭孢菌素如頭孢曲松、頭孢他啶等也有較高耐藥率，對新的第四代頭孢菌素如頭孢吡肟也有將近40.00%的耐藥率。產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對常用的喹諾酮類藥物如環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率較高，約80.00%，對常用的氨基糖苷類藥物如慶大霉素、妥布霉素有60.00%左右的耐藥率，多藥耐藥現(xiàn)象非常嚴重，且這一數(shù)據(jù)遠遠超過CHINET全國監(jiān)測數(shù)據(jù)[2]。對于酶抑制劑復合抗生素，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率遠高于哌拉西林/他唑巴坦，分別為36.00%和8.00%，可能與前者在該院臨床應用較廣有關。頭孢西丁作為頭霉素類藥物，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對其耐藥率已達46.67%。碳青霉烯類藥物耐藥多見于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等[4-5]，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對其仍較敏感[6]，所檢菌株中只有1株對厄他培南耐藥，對亞胺培南敏感率100.00%，說明碳青霉烯類藥物仍可作為治療產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌最有效的藥物，但要注意監(jiān)測耐藥菌株的出現(xiàn)。

PCR結果顯示，所有菌株中有1株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌未檢測到上述耐藥基因，可能為其他少見基因型[7]。從PCR結果可以看到本研究中大腸埃希菌ESBLs基因型以TEM和CTX-M為主，但目前為止我國流行的ESBLs主要是以水解頭孢噻肟為主的CTX-M型ESBLs，所檢測出的TEM型基因也多為廣譜β-內(nèi)酰胺酶TEM-1型，ESBLs型的報道很少[8-10]。為明確該院流行的TEM基因型到底是廣譜還是超廣譜酶，將所有TEM擴增陽性基因測序比對后，發(fā)現(xiàn)均為TEM-1基因亞型，TEM-1基因為廣譜β-內(nèi)酰胺酶，而非ESBLs類。

根據(jù)氨基酸序列的同源性，可將CTX-M型ESBLs分為5個組。本研究中產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌主要檢出CTX-M-9組和CTX-M-1組，CTX-M-9組中CTX-M-14亞型檢出最多，CTX-M-1組中以CTX-M-55亞型為主。近年來，能夠水解頭孢他啶的CTX-M-15已成為全球最常見的ESBLs亞型，甚至在部分國家地區(qū)暴發(fā)流行[11]。本研究共檢出7株產(chǎn)CTX-M-15亞型ESBLs的大腸埃希菌，檢出率9.33%，應引起足夠重視。本研究中4株SHV基因均為SHV-12亞型，是亞洲地區(qū)主要流行亞型之一[12]。傳統(tǒng)產(chǎn)OXA基因菌株主要為銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等，本次檢測的產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌中檢測出8株OXA-1亞型和3株OXA-10亞型基因，可能由于OXA基因多位于質(zhì)粒上，具有很強的擴散能力，容易通過轉化、結合等方式轉移至大腸埃希菌。

大腸埃希菌的耐藥問題越來越嚴重，產(chǎn)ESBLs菌株多為多重耐藥，臨床治療越發(fā)困難。加強對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的耐藥監(jiān)測和基因監(jiān)測，對臨床合理應用抗生素、預防和控制ESBLs在醫(yī)院內(nèi)的傳播流行具有重要意義。

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Drug resistance and genotype of ESBLs-producingisolated from patients in Ningbo Second Hospital

Objective To investigate the drug resistance and genotypes of extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)-producingisolated from patients in Ningbo Second Hospital．Methods Clinical strains ofwere isolated from inpatients of Ningbo Second Hospital during December 2013 and May 2014．Drug resistance was detected and genotype of ESBLs was determined by PCR method．Results All 75 clinical isolates ofwere resistant to ampicillin,and showed high resistance rate of third-generation cephalosporins,fluoroquinolones and aminoglycosides．The positive rates of ESBLs-producing genotypes TEM,CTX-M-9 group,CTX-M-1 group,OXA-1 group,SHV,OXA-10 group were 85．33%(64),81．33%(61),49．33%(37),10．67%(8),5．33%(4)and 4．00%(3),respectively．The genotype of 64 isolates with TEM gene was TEM-1．The main genotypes of CTX-M group were CTX-M-14 and CTX-M-55,which account for 61．33%(46)and 29．33%(22),respectively;while CTX-M-3,CTX-M-15,CTX-M-24,CTX-M-27,CTX-M-65,CTX-M-69 and CTX-M-79 genotypes accounted for fewer percentage of CTX-M genotype．The genotype of 8 isolates with OXA-1 gene was OXA-1,those of 4 isolates with SHV gene and 3 isolates with OXA-10 gene were SHV-12 and OXA-10,respectively．Conclusion The drug resistant rate of ESBLs-producingin this hospital is high,and the most prevalent genotype of ESBLs is CTX-M．

Extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)Drug resistance Genotype型分析，對指導臨床合理應用抗生素，預防和控制感染有重要意義。

2014-08-11）

（本文編輯：胥昀）

寧波市科技創(chuàng)新團隊（2011B82016）；寧波市社發(fā)重大專項基金（2010C50038）

315000 寧波大學醫(yī)學院（陳夢婷系在讀研究生，現(xiàn)在寧波市第二醫(yī)院實習）；寧波市第二醫(yī)院干細胞實驗室（張順、蔡挺）

蔡挺，E-mail:caiting@nbu.edu.cn

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lacta- mases，ESBLs）可以水解青霉素、廣譜及超廣譜頭孢菌素和單環(huán)β-內(nèi)酰胺抗生素，是臨床上大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要機制。近年來對耐藥大腸埃希菌感染的預防與治療已逐漸成為臨床醫(yī)師需要面對的重要問題[1]，而不同地區(qū)使用抗生素的種類和頻率不同將導致不同基因型的ESBLs產(chǎn)生，后者則可以表現(xiàn)出相同或者不同的耐藥表型，從而影響臨床治療的效果。因此對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進行耐藥譜和基因