管彩虹 樓雅芳 趙凱 朱黎紅 吳清

趨化因子CCL22誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中ERK/p38MAPK蛋白的表達(dá)

管彩虹 樓雅芳 趙凱 朱黎紅 吳清

目的 探討趨化因子CCL22誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中ERK/p38MAPK蛋白的表達(dá)。方法 以100ng/ml的CCL22誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞SBC-5后，采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化及加入蛋白激酶抑制劑U0126后細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。以Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 加入100ng/ml的CCL22后，對(duì)照組、CCL22組、混合組SBC-5細(xì)胞平均遷移距離分別為（112．6±27．2）、（351．9±16．4）、（145．1±29．6）μm，CCL22組細(xì)胞遷移距離明顯大于對(duì)照組和混合組（均P＜0．05）。對(duì)照組、CCL22組、混合組平均侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（199．2±32．8）、（505．5±66．3）、（95．7±19．1）個(gè)，CCL22組顯著高于對(duì)照組和混合組（均P＜0．05），而混合組明顯低于對(duì)照組（P＜0．05）。100ng/ml的CCL22誘導(dǎo)后，p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)增加，U0126可減低以上蛋白的表達(dá)（P＜0．05）。結(jié)論 ERK/p38MAPK蛋白激酶參與了趨化因子CCL22誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

肺癌 趨化因子CCL22 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 p38絲裂原活化蛋白激酶 腫瘤轉(zhuǎn)移

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，常發(fā)生骨、肝臟等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，迄今為止其侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全明確。以往研究發(fā)現(xiàn)，分化的破骨細(xì)胞可產(chǎn)生趨化因子CCL22，其相應(yīng)的受體為趨化因子受體4（CCR4）。CCL22能誘導(dǎo)表達(dá)CCR4的人肺癌細(xì)胞系SBC-5細(xì)胞發(fā)生遷移[1]，同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞在分化與激活過程中還產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與不同的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合后能激活多信號(hào)傳導(dǎo)通路。而目前對(duì)于細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）通路是否參與肺癌轉(zhuǎn)移，尚未見報(bào)道。本研究以SBC-5細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察CCL22誘導(dǎo)下肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ERK和p38MAPK蛋白表達(dá)的情況，進(jìn)一步探討ERK/p38MAPK信號(hào)通路在肺癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 人肺癌細(xì)胞系SBC-5細(xì)胞購(gòu)于廣州吉妮歐生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、蛋白激酶抑制劑U0126購(gòu)于美國(guó)Sigma公司?；瘜W(xué)發(fā)光試劑（ECL）Plus試劑盒、IP細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司。ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK和GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。ECLIPSE Ti-S型倒置相差顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SBC-5細(xì)胞復(fù)蘇后以含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，并調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度CCL22誘導(dǎo)SBC-5細(xì)胞，侵襲實(shí)驗(yàn)及Western blot均顯示100ng/ml作用24h誘導(dǎo)效果最明顯（本文中未顯示相關(guān)結(jié)果），因此本研究CCL22濃度選擇100ng/ml。設(shè)對(duì)照組、CCL22組（100ng/ ml）、混合組（100ng/ml CCL22+10μmol/L U0126），分別培養(yǎng)24h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106/孔細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，同步化培養(yǎng)24h。用200μl移液器尖端垂直6孔板底部劃線，以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基漂洗兩遍。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，在倒置相差顯微鏡下選擇背景最好的3個(gè)視野拍照（×100）。

1.2.3 Transwell試驗(yàn)觀察細(xì)胞侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，同步化培養(yǎng)24h。以無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，取100μl稀釋液加到24孔transwell上室，下室加入600μl各組培養(yǎng)基。每組加入相應(yīng)藥物，培養(yǎng)24h后用棉簽擦去上室非侵襲細(xì)胞，移去transwell，予倒置風(fēng)干，取4個(gè)視野（×100），染色、照相后計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，分別加入1:500稀釋的ERK、p-ERK、p38MAPK、p-p38MAPK和GAPDH抗體，4℃過夜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u動(dòng)2h。TBS-T漂洗，ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較行多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CCL22對(duì)SBC-5細(xì)胞遷移能力的影響 100ng/ml的CCL22誘導(dǎo)后，對(duì)照組SBC-5細(xì)胞平均遷移距離（112.6±27.2）μm，CCL22組細(xì)胞平均遷移距離（351.9± 16.4）μm，混合組細(xì)胞平均遷移距離（145.1±29.6）μm。CCL22組細(xì)胞遷移距離明顯大于對(duì)照組和混合組（均P＜0.05），混合組和對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖1。

2.2 CCL22對(duì)SBC-5細(xì)胞侵襲能力的影響 100ng/ml的CCL22誘導(dǎo)SBC-5細(xì)胞24h后，對(duì)照組平均穿膜細(xì)胞數(shù)（199.2±32.8）個(gè)，CCL22組平均穿膜細(xì)胞數(shù)（505.5±66.3）個(gè)，混合組平均穿膜細(xì)胞數(shù)（95.7±19.1）個(gè)。CCL22組顯著高于對(duì)照組和混合組（均P＜0.05），混合組明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），見圖2。

圖1 培養(yǎng)24h后各組SBC-5細(xì)胞遷移能力的變化（A：對(duì)照組0h；B：CCL22組0h；C：混合組0h；D：對(duì)照組24h；E：CCL22組24h；F：混合組24h；×100）

圖2 培養(yǎng)24h后各組SBC-5細(xì)胞侵襲能力的變化（A：對(duì)照組；B：CCL22組；C：混合組；HE染色，×100）

2.3 CCL22對(duì)SBC-5細(xì)胞p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 100ng/ml的CCL22誘導(dǎo)12h和24h后，SBC-5細(xì)胞p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，并呈時(shí)間依賴性，而U0126可顯著性減低CCL22引起的蛋白表達(dá)增高（P＜0.05），見圖3。

圖3 培養(yǎng)12h和24h后各組SBC-5細(xì)胞內(nèi)p-ERK和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)

3 討論

在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中，靶器官的趨化作用至關(guān)重要。腫瘤的轉(zhuǎn)移不是隨機(jī)的，而是具有嗜器官性的，趨化因子在其中發(fā)揮著重要的作用。近年來的研究證實(shí)，靶器官產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子，如白介素、細(xì)胞核因子κB配基受體激活劑、趨化因子等與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的特異性受體結(jié)合，在腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲過程中發(fā)揮著重要作用[2]。

趨化因子家族是一類由免疫或非免疫細(xì)胞分泌的一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的小分子蛋白，具有多種生物學(xué)活性。根據(jù)其氨基酸序列上前兩個(gè)半胱氨酸相對(duì)位置不同可分為4類，CCL22就是其中一類，在人體中由位于16號(hào)染色體的CCL22基因編碼，由樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生。Nakamura等[1]研究發(fā)現(xiàn)分化的破骨細(xì)胞也可以產(chǎn)生趨化因子CCL22，其相應(yīng)的受體為CCR4。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用100ng/ml的CCL22處理肺癌SBC-5細(xì)胞24h后，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增加，說明趨化因子CCL22對(duì)肺癌細(xì)胞有明顯的趨化作用，加入蛋白激酶抑制劑U0126后，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力則明顯減弱。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶超家族，是將細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)傳遞至細(xì)胞核并引起細(xì)胞核發(fā)生變化的重要物質(zhì)。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)著機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、分裂、死亡以及細(xì)胞間功能同步化。在目前人類鑒定的4條MAPK通路（ERK、JNK/SAPK、BMK和p38MAPK）中，ERK和p38MAPK途徑為MAPK級(jí)聯(lián)途徑的原型，在信號(hào)傳導(dǎo)過程中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)U0126主要是抑制ERK磷酸化，ERK可將細(xì)胞外刺激傳遞至細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化等一系列生理活動(dòng)，并在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)展中起重要作用[3]。

目前對(duì)于腫瘤組織中ERK和p38MAPK蛋白表達(dá)的研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議。Bang等[4]在胃癌組織中檢測(cè)到ERK蛋白表達(dá)增強(qiáng)；Price等[5]對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤和前列腺癌組織的研究則發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中ERK/p38MAPK蛋白表達(dá)未見明顯增加。韓艷春等[6]在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p-ERK和p-p38MAPK表達(dá)顯著升高，且兩者表達(dá)與腫瘤的預(yù)后顯著相關(guān)。趙凱等[7]研究發(fā)現(xiàn)人可溶性核因子κB受體活化因子配體（shRANKL）誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)ERK和p38MAPK蛋白表達(dá)均顯著增加。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CCL22作用SBC-5細(xì)胞后，p-ERK和p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯上升，U0126可顯著削弱CCL22引起的蛋白表達(dá)增加，由此推測(cè)CCL22誘導(dǎo)肺癌SBC-5細(xì)胞遷移和侵襲能力增加，可能是通過ERK磷酸化引起的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL22對(duì)肺癌細(xì)胞有明顯的趨化作用，該作用可能是通過ERK磷酸化實(shí)現(xiàn)的，蛋白激酶抑制劑可顯著抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，本研究結(jié)果可能會(huì)為肺癌轉(zhuǎn)移的治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Nakamura E S,Koizumi K,Kobayashi M,et al．RANKL-induced CCL22/macrophage-derived chemokine produced from osteoclasts potentially promotes the bone metastasis of lung cancer expressing its receptor CCR4[J]．Clin Exp Metastasis,2006,23(1): 9-18．

[2]Vander Griend D J,Rinker-Schaeffer C W．A new look at an old problem:the survival and organ-specific growth of metastases [J]．Sci STKE,2004,2004(216):3-9．

[3]Aisa Y,Miyakawa Y,Nakazato T,et al．Fucoidan induces apoptosis of human HS-sultan cells accompanied by activation of caspase-3and down-regulation of ERKpathways[J]．AmJHematol,2005,78(1):7-14．

[4]Bang Y J,Kwon J H,Kang S H,et al．Increased MAPK activity and MKP-1 overexpression in human gastric adenocarcinoma [J]．Biochem Biophys Res Commun,1998,250(1):43-47．

[5]Price D T,Della Rocca G,Guo C,et al．Activation of extracellular signal-regulated kinase in human prostate cancer[J]．J Urol,1999, 162(4):1537-1542．

[6]韓艷春,曾憲旭,王睿,等．p39MAPK信號(hào)通路與uPA在乳腺癌細(xì)胞及組織中表達(dá)的相關(guān)性[J]．癌癥,2007,26(1):48-53．

[7]趙凱,譚群亞,楊翀,等．干擾ERK/p-38 MAPK信號(hào)通路對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響[J]．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2011,28(2):311．

Express of ERK/p38MAPK protein in lung cancer cell migration and invasion induced by chemokine CCL22

Objective To investigate the express of ERK/p38MAPK proteins in lung cancer cell migration and invasion induced by chemokine CCL22．Methods Lung cancer SBC-5 cells were cultured with 100ng/ml CCL22(CCL22 group)or CCL22 and protein kinase inhibitor U0126(CCL22+U0126 group)．Cell migration and invasion was measured by Transwell method and scratch assay;the expression of p-ERK and p-p38MAPK in SBC-5 cells was determined by Western blot．Results The distances of cell migration in control,CCL22 and CCL22+U0126 groups were(112．6±27．2)μm,(351．9±16．4)μm and(145．1±29．6) μm,respectively(P＜0．05);the numbers of migrant cells in three groups were(199．2±32．8),(505．5±66．3)and(95．7±19．1),respectively(P＜0．05)．The expression of p-ERK and p-p38MAPK protein was significantly higher than that in control and CCL22+U0126 groups(P＜0．05)．Conclusion The expression of ERK/p38MAPK protein is up-regulated,indicating that ERK/ p38MAPK proteins may be involved in CCL22 induced lung cancer cell migration and invasion induced by chemokine CCL22．

Lung cancerChemokine CCL22 ERK P38MAPK Cancer migration

2014-06-11）

（本文編輯：胥昀）

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011A046）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011KYA138）

310009 杭州市中醫(yī)院呼吸科（管彩虹、樓雅芳、朱黎紅、吳清）；杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院普外科（趙凱）

趙凱，E-mail:zhaokaiguan@126.com