章輝 陶芳芳 曹學(xué)全 盧洪勝 范廣民 孫剛

HuR和HIF-1α在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達(dá)及意義

章輝 陶芳芳 曹學(xué)全 盧洪勝 范廣民 孫剛

目的 探討乳腺浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）中HuR和HIF-1α蛋白的表達(dá)及意義。方法 采用免疫組化（PV-8000二步法）檢測52例乳腺IDC組織標(biāo)本和15例正常對照乳腺組織標(biāo)本中HuR、HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 HuR和HIF-1α蛋白在乳腺IDC組織中陽性表達(dá)率均明顯高于正常對照乳腺組織（均P＜0．01）；兩者表達(dá)均與乳腺IDC的臨床分期和組織學(xué)分級有關(guān)（均P＜0．05），而與年齡、腫瘤大小無關(guān)（均P＞0．05）；HIF-1α蛋白在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05），而HuR蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）；HuR和HIF-1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0．05）。結(jié)論 乳腺IDC中HuR和HIF-1α蛋白表達(dá)均增高，并與臨床分期和組織學(xué)分級相關(guān)。

HuR HIF-1α 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，位居女性癌癥病死率的首位。在我國乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，且發(fā)病趨于年輕化，其中又以浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）占絕大多數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，HuR是Hu家族中至今發(fā)現(xiàn)的唯一在人體組織廣泛表達(dá)的蛋白（除神經(jīng)組織外），是目前被公認(rèn)的mRNA結(jié)合蛋白之一，在腫瘤的增殖分化、細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、血管新生和免疫逃避中發(fā)揮作用[1-3]。而缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是廣泛存在于人體內(nèi)的一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等方面起著十分重要的作用[4]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法（IHC）檢測HuR和HIF-1α蛋白在乳腺IDC組織中的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系，探討兩者在乳腺IDC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，為乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診治及預(yù)后判斷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 一般資料 收集臺州市中心醫(yī)院病理科2011-10—2013-10經(jīng)手術(shù)切除，并且病史完整的乳腺IDC石蠟包埋組織標(biāo)本52例，另取同期癌旁5cm外的正常乳腺組織15例作為正常對照。所有患者均為女性，年齡32～72歲，中位年齡53歲；均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?；颊呤中g(shù)前均未接受放、化療及內(nèi)分泌治療。其中接受改良根治術(shù)47例，保乳術(shù)5例；低分化癌35例，中、高分化17例；臨床分期Ⅰ期21例，Ⅱ期23例，Ⅲ期8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例。所有切片經(jīng)病理科多位診斷醫(yī)師閱片證實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人HuR單克隆抗體購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；鼠抗人HIF-1α單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。PV-8000檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 檢測方法 標(biāo)本經(jīng)10.00%中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。IHC染色采用PV-8000二步法：切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，置于檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中加熱行抗原修復(fù)，室溫冷卻后磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌，滴加一抗，置濕盒4℃冰箱過夜。PBS洗滌后滴加二抗，室溫中孵育30min，再行PBS洗滌后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 染色結(jié)果判斷 在排除非特異性染色的前提下，HuR蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核，HIF-1α蛋白亦主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。顯微鏡下凡定位區(qū)域出現(xiàn)清晰的棕黃色染色的細(xì)胞即為陽性細(xì)胞。觀察5個以上高倍鏡視野，計(jì)數(shù)不少于1 000個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，陽性細(xì)胞數(shù)＜10.00%為陰性，≥10.00%為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 HuR和HIF-1α蛋白在乳腺IDC及正常對照乳腺組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，HuR蛋白定位于細(xì)胞核（癌旁正常對照乳腺組織細(xì)胞偶有少量核染色），呈棕黃色顆粒（見圖1A）；HIF-1α蛋白陽性表達(dá)亦主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，少量分布于細(xì)胞質(zhì)（見圖1B）。在正常對照乳腺組織中HuR和HIF-1α不表達(dá)，均為0.00%（0/15）。在乳腺IDC中，HuR蛋白表達(dá)陽性率為55.77%（29/52），HIF-1α蛋白表達(dá)陽性率為73.08%（38/52），HuR和HIF-1蛋白在乳腺IDC組織中的表達(dá)陽性率均高于正常對照組織（χ2=14.749、25.325，均P＜0.01）。

2.2 乳腺IDC組織中HuR和HIF-1α表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺IDC組織中HuR和HIF-1α蛋白表達(dá)均與臨床分期及組織學(xué)分級相關(guān)（均P＜0.05），而與年齡及腫瘤大小無關(guān)（均P＞0.05）；在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，HuR表達(dá)分別為57.14%（24/42）和50.00%（5/10），無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而HIF-1α表達(dá)分別為78.57%（33/42）和50.00%（5/10），兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

圖1 HuR和HIF-1α在乳腺IDC組織中的表達(dá)（A：HuR；B：HIF-1α；免疫組化PV-8000二步法染色，×400）

表1 HuR和HIF-1α蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 HuR和HIF-1α蛋白在乳腺IDC組織中表達(dá)的相關(guān)性 在52例乳腺IDC標(biāo)本中，HuR和HIF-1α蛋白表達(dá)均為陽性的共25例，表達(dá)均為陰性的共10例。Spearman等級相關(guān)分析顯示，HuR、HIF-1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.332，P＜0.05），見表2。

表2 HuR和HIF-1α蛋白在乳腺IDC組織中表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

Hu家族因與果蠅體內(nèi)的胚胎致死性異常視覺蛋白同源[3]，所以又被稱為類胚胎致死異常視覺（ELAVL）家族，Hu家族有4個成員：HuB（He1-N1）、HuC、HuD和HuR，前3個成員主要在終端分化的神經(jīng)組織表達(dá)并與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，而HuR（又名ELAV1）是一種廣譜mRNA結(jié)合蛋白，在許多組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)。HuR通過和細(xì)胞內(nèi)mRNA非翻譯區(qū)富含Au元件（AREs）的結(jié)合，保持mRNA的穩(wěn)定性，使之不易被降解從而增強(qiáng)其表達(dá)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用[5-6]。在生理狀態(tài)下，HuR主要定位在細(xì)胞核，功能是與靶基因的mRNA結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)，在此過程中HuR保護(hù)mRNA避免衰變降解。在病理狀態(tài)下，HuR在胞質(zhì)表達(dá)增加，阻止含AREs靶基因的脫腺苷化降解過程，延長mRNA壽命，使其蛋白產(chǎn)物異常增加[7]。研究發(fā)現(xiàn)，HuR在眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，參與了腫瘤的增殖分化、細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避等[2-3，8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，HuR蛋白在乳腺IDC組織中表達(dá)的陽性率明顯高于正常對照乳腺組織，與胡躍云等[2]的研究結(jié)果一致，提示HuR可能參與乳腺癌的早期事件之一，為進(jìn)一步闡明HuR導(dǎo)致乳腺IDC的發(fā)生機(jī)制提供了有力證據(jù)。通過HuR蛋白與乳腺IDC臨床病理特征分析結(jié)果顯示，HuR蛋白表達(dá)與乳腺IDC臨床分期、分化程度相關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示HuR蛋白可能與乳腺IDC的發(fā)生及預(yù)后相關(guān)。

HIF最初被認(rèn)為是調(diào)節(jié)促紅細(xì)胞生成素（EPO）合成的調(diào)節(jié)因子。HIF由2個亞基構(gòu)成，具有氧不穩(wěn)定性的α亞基，在缺氧的環(huán)境下迅速變得穩(wěn)定；另一個穩(wěn)定的、高度保守的β亞基，也稱為芳烴受體核轉(zhuǎn)位分子（ARNT）[10]。哺乳動物的HIFα有3種亞型，其中HIF-1α和HIF-2α這2種亞基結(jié)構(gòu)非常相似，而HIF-3α是一種多樣的剪接變體，以顯性失活方式抑制前兩種亞型的活性。HIF-1α亞基在所有細(xì)胞中都普遍存在，而HIF-2α和HIF-3α則在特定的組織中表達(dá)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。近年研究發(fā)現(xiàn)：HIF-1α的表達(dá)及其下游缺氧應(yīng)激反應(yīng)的激活在多種腫瘤中普遍存在，揭示了HIF調(diào)節(jié)的基因作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)，例如：腫瘤細(xì)胞增殖、代謝、凋亡和自噬、細(xì)胞外基質(zhì)的重塑、腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移、血管生成、DNA損傷與修復(fù)等，研究發(fā)現(xiàn)HIF表達(dá)上調(diào)是多種癌癥的預(yù)后不良因素[11-13]。本研究對52例乳腺IDC檢測提示，HIF-1α蛋白陽性表達(dá)明顯高于正常對照乳腺組織，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明HIF-1α蛋白是一種促癌細(xì)胞增殖的基因蛋白，與趙迎春等[12]研究結(jié)果相同。分析HIF-1α與患者臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白表達(dá)與乳腺IDC臨床分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，而與患者年齡及腫瘤大小無關(guān)，推測HIF-1α蛋白可能與乳腺IDC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，在乳腺IDC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中，HuR蛋白和HIF-1α蛋白均呈現(xiàn)出不同程度的陽性表達(dá)，這兩種蛋白有望成為判斷乳腺IDC預(yù)后的一個重要指標(biāo)。針對這兩種蛋白進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)，也有可能為乳腺IDC的早期診斷和治療開辟新的途徑。

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Expression of HuR and HIF-1α in infiltrating ductal carcinoma of breast and its clinical significance

Objective To investigate the expression of HuR and HIF-1α proteins in infiltrating ductal carcinoma of breast (IDC)and its clinical significance．Methods The expressions of HuR and HIF-1α in 52 cases of IDC and 15 samples of normal breast tissue were detected by immunohistochemical(PV-8000 method)．Results The expressions of HuR and HIF-1α proteins in IDC tissues were both significantly higher than those in normal breast tissue (both P＜0．05)．The expressions of HuR and HIF-1α proteins in IDC tissues were correlated with the clinical stage and histological grade (both P＜0．05);while not correlated with age and tumor size(both P＞0．05)．The lymph node metastasis was correlated with HIF-1α expression (P＜0．05),but not with HuR expression(P＞0．05)．HuR expression was positively correlated with HIF-1α expression in IDC(P＜0．05)．Conclusion The expression of HuR and HIF-1α proteins are increased in IDC,and the expression is correlated with clinical stage and histological grade of the cancer．

HuR HIF-1α Infiltrating ductal carcinoma of breast

2014-08-25）

（本文編輯：胥昀）

318000 臺州恩澤醫(yī)療集團(tuán)臺州市中心醫(yī)院病理科通信作者：曹學(xué)全，E-mail：caoxuequan@126.com