段虹宇 朱良才 彭余江 邵波 李慧勇

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對顱腦外傷大鼠核轉(zhuǎn)錄因子p65、干擾素-γ和細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

段虹宇 朱良才 彭余江 邵波 李慧勇

目的 探討腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）對顱腦外傷大鼠核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）p65、IFN-γ和細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法 將112只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為BDNF組（56只）及對照組（56只），BDNF組通過改良Feeney法建立顱腦外傷模型后立即予腹腔注射BDNF 0．5μg/μl，對照組建模后予腹腔注射0．9%氯化鈉注射液2ml/kg，以后兩組每24h分別腹腔注射1次等量BDNF或0．9%氯化鈉注射液，直至大鼠被處死，根據(jù)處死時(shí)間分為1、3、6、12、24h、3d和7d共7個(gè)亞組，每亞組各8只。比較腦挫傷灶周圍腦組織NF-κB p65及IFN-γ的表達(dá)情況，同時(shí)采用TUNEL法觀察并比較腦挫傷灶周圍細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果BDNF組NF-κB p65及IFN-γ蛋白表達(dá)較均對照組明顯降低（均P＜0．05），且兩組中兩者表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（均P＜0．01）；同時(shí)BDNF組細(xì)胞凋亡率較對照組也有所減低（P＜0．05）。結(jié)論 顱腦外傷后BDNF能夠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可能與BDNF降低NF-κB p65活性，控制炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

顱腦外傷 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 核轉(zhuǎn)錄因子p65 干擾素-γ 細(xì)胞凋亡

在機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、成熟及再生方面具有重要意義。既往研究報(bào)道，在腦缺血、腦出血、癲癇和低血糖發(fā)作時(shí)BDNF的表達(dá)均明顯增加，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都證實(shí)了外源性BDNF對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)效應(yīng)[1]。然而，BDNF對于顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是否具有神經(jīng)保護(hù)作用目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究采用改良Feeney法制備TBI模型后以BDNF進(jìn)行干預(yù)，觀察NF-κB p65以及IFN-γ表達(dá)的變化及細(xì)胞凋亡的情況，探討TBI后BDNF是否具有保護(hù)神經(jīng)作用及其可能機(jī)制，為TBI患者的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 清潔級雄性SD大鼠112只由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號：浙醫(yī)動(dòng)字第2203001號），體重250～280g，平均（280± 20）g，月齡3～4個(gè)月。實(shí)驗(yàn)大鼠均分籠飼養(yǎng)，飼喂全價(jià)顆粒飼料，自由飲水，室內(nèi)溫度（22±2）℃，濕度55%～65%，光照適度，通風(fēng)潔凈。術(shù)前不禁水，禁食12h，按隨機(jī)數(shù)字表法分為BDNF組（56只）及對照組（56只），再根據(jù)處死時(shí)間分為1、3、6、12、24h、3d和7d共7個(gè)亞組，每亞組各8只。

BDNF購于美國R&D Systems公司，NF-κB p65及IFN-γ免疫組化試劑盒購于美國Sigma公司，原位末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購于美國Promega公司，電子顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物模型制備及處置 按照霍永強(qiáng)等[2]的改良Feeney法自由落體腦創(chuàng)傷模型制作閉合性TBI模型。建模成功標(biāo)志：大鼠出現(xiàn)肢體抽搐、意識障礙及瞳孔改變，傷后各項(xiàng)反射消失，并在45min內(nèi)恢復(fù)[3]。待大鼠自然蘇醒后，BDNF組予腹腔注射BDNF 0.5μg/μl，對照組則經(jīng)腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2ml/kg，以后每24h各組分別腹腔注射1次等體積的BDNF或0.9%氯化鈉注射液，直至大鼠被處死。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 腦組織中NF-κB p65及IFN-γ的表達(dá) 大鼠麻醉后以0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行心臟灌洗，4℃的10%多聚甲醛灌洗固定，迅速斷頭取腦。損傷腦組織選取距腦挫傷灶邊緣約5mm處的腦皮質(zhì)，制成蠟塊后自前往后行5μm連續(xù)冠狀位切片。每個(gè)標(biāo)本取2張切片，嚴(yán)格按相關(guān)試劑盒檢測要求進(jìn)行操作，在顯微鏡下隨機(jī)觀察挫傷灶周圍5個(gè)不重復(fù)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算表達(dá)陽性率。表達(dá)陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.2 TUNEL染色 嚴(yán)格按照試劑盒檢測步驟進(jìn)行操作。在光鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表凋亡細(xì)胞，計(jì)算TUNEL陽性率并采集圖片。TUNEL陽性率（細(xì)胞凋亡率）=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩變量之間相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠NF-κB p65蛋白表達(dá)情況 損傷后1h時(shí)，BDNF組挫傷灶周圍組織細(xì)胞核中NF-κB p65開始表達(dá)，3～12h表達(dá)陽性率逐漸增高，24h時(shí)達(dá)到高峰，3～7d時(shí)有所下降，但處于高表達(dá)狀態(tài)。與對照組比較，各時(shí)間點(diǎn)均低于對照組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見表1及圖1。

2.2 各組大鼠IFN-γ蛋白表達(dá)情況 損傷后1h時(shí)，

BDNF組挫傷灶周圍組織中IFN-γ開始表達(dá)，3h開始大量表達(dá)，損傷后3d IFN-γ表達(dá)達(dá)到高峰，至7d表達(dá)下降。與對照組比較，各時(shí)間點(diǎn)IFN-γ表達(dá)陽性率較低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見表1及圖2。

圖1 BDNF組大鼠NF-κB p65蛋白表達(dá)情況（A：BDNF組1h；B：BDNF組3d；C：BDNF組7d；免疫組化SABC法染色，×400）

圖2 BDNF組大鼠IFN-γ蛋白表達(dá)情況（A：BDNF組1h；B：BDNF組3d；C：BDNF組7d；免疫組化SABC法染色，×400）

圖3 BDNF組大鼠細(xì)胞凋亡情況（A：BDNF組1h；B：BDNF組3d；C：BDNF組7d；TUNEL染色，×400）

表1 各組NF-κB p65、IFN-γ表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況比較（%）

2.3 各組大鼠細(xì)胞凋亡情況 TUNEL染色后細(xì)胞核呈棕褐色提示為凋亡細(xì)胞。損傷后1h時(shí)，BDNF組腦挫傷灶周圍開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，3～24h凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，3d達(dá)到高峰，7d凋亡細(xì)胞有所減少，與對照組變化規(guī)律一致，但各時(shí)間凋亡細(xì)胞數(shù)較對照組低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），見表1和圖3。 2.4 各組大鼠NF-κB p65與IFN-γ蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 各組大鼠腦組織NF-κB p65與IFN-γ表達(dá)均呈正相關(guān)（均P＜0.05），以NF-κB p65含量為自變量，用x表示；IFN-γ含量為應(yīng)變量，用表示?；貧w方程1=-0.432+0.271x，r2=0.947（P＜0.01），1=-4.168+ 0.748x，r2=0.961（P＜0.01）。

3 討論

目前TBI的發(fā)病率呈持續(xù)升高的趨勢[4]，造成患者勞動(dòng)力的喪失并花費(fèi)巨額的醫(yī)療資源，對家庭和社會造成巨大的影響。因此，如何阻止TBI后繼發(fā)性腦損傷的出現(xiàn)和發(fā)展，一直是眾多科研和臨床工作者的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，腦損傷灶和周圍組織存在炎性反應(yīng)，腦組織損傷后誘導(dǎo)IFN-γ的釋放表達(dá)，是繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)[5-7]。此外，有研究表明IFN-γ可活化p38激酶，誘導(dǎo)Ⅱ類組織相容性復(fù)合體（MHC）及細(xì)胞因子的表達(dá)，共同參與神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，在TBI后細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8]。因此，如何降低包括IFN-γ在內(nèi)的諸多細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，保護(hù)受損細(xì)胞，是目前TBI后神經(jīng)保護(hù)治療的一大靶點(diǎn)。

國外研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)抗原刺激的免疫細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞能表達(dá)BDNF mRNA和BDNF蛋白[9]，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中都觀察到，外源性BDNF對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)效應(yīng)[1]。然而對于BDNF在TBI中是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，TBI后BDNF組IFN-γ水平較對照組明顯下降，提示BDNF干預(yù)可在一定程度抑制IFN-γ的表達(dá)，減輕腦組織的炎癥反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在體內(nèi)外多種因素刺激誘導(dǎo)下，由多種基因調(diào)控的主動(dòng)死亡過程。BDNF不僅對多種神經(jīng)元的分化、增殖和存活起重要作用，而且經(jīng)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BDNF能抑制腦缺血及創(chuàng)傷等腦損傷中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。已有研究證明，在損傷狀態(tài)下BDNF與酪氨酸激酶受體B（Tr kB）結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑，通過維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，提高抗氧化酶活性及刺激細(xì)胞的修復(fù)酶系統(tǒng)，減少氧自由基，抑制神經(jīng)元凋亡過程，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法檢測了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBI后BDNF組大鼠細(xì)胞凋亡較對照組明顯改善，NF-κB p65和IFN-γ的表達(dá)顯著降低且兩者呈正相關(guān)。由此，筆者認(rèn)為BDNF也可通過抑制NF-κB p65的釋放，進(jìn)而減少促炎介質(zhì)IFN-γ的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，BDNF可通過負(fù)性調(diào)節(jié)腦組織中NF-κB p65的表達(dá)，進(jìn)一步減少促炎介質(zhì)IFN-γ的釋放，減輕了大鼠TBI后的繼發(fā)性腦損傷，從而抑制了神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為BDNF在TBI中的臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Protective effects of brain-derived neutrophic factor on traumatic brain injury and its mechanisms in rats

Objective To investigate the effects of brain-derived neutrophic factor(BDNF)on traumatic brain injury and its mechanisms in rats．Methods One hundred and twelve male SD rats were randomly divided into 2 groups:the control group (n=56)and BDNF group(n=56)．The traumatic brain injury was induced by improved Feeney method;immediately after injury the rats received abdominal injections of 2ml/kg normal saline(control group)or 0．5μg/μl BDNF(BDNF group)and repeat every 24 h until the animals were sacrificed．According to sacrifice time the rats were divided 7 subgroups(1h,3h,6h,12h,24h,3d,and 7d)with 8 in each subgroup．The expression of NF-κB p65 and IFN-γ was determined by immunohistochemistry and cell apoptosis was detected by TUNEL method in brain tissue surrounding the contusion areas．Results The expression of NF-κB p65 and the IFN-γ in BDNF group was significantly lower than that in control group(P＜0．05)．The expression of IFN-γ was positively correlated with NF-κB p65 in both groups(P＜0．01)．The number of apoptotic cells in BDNF group was significantly less than that in control group(P＜0．05)．Conclusion BDNF can protect traumatic brain injury in rats,which may be associated with its effect of relieving inflammation response and reducing neural cell apoptosis．

Traumatic brain injury Brain-derived neutrophic factorNF-κB p65 IFN-γ Cell apoptosis

2014-09-19）

（本文編輯：胥昀）

溫嶺市科技局科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目（2011WLCB 0093）

317500 臺州，溫嶺市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科

李慧勇，E-mail：huiyouli@126.com