徐文財，劉 秋，李 旦，胡序明,，吳庚華，錢 琨,,3，邵紅霞,,3，金文杰,,3，秦愛建,,3

（1.揚州大學(xué)教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州 225009；2.揚州 大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

雞β2-微球蛋白的基因克隆與原核表達(dá)

徐文財1，劉 秋1，李 旦1，胡序明1,2，吳庚華2，錢 琨1,2,3，邵紅霞1,2,3，金文杰1,2,3，秦愛建1,2,3

（1.揚州大學(xué)教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州 225009；2.揚州 大學(xué)江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，揚州 225009；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

本研究通過RT-PCR從正常雞外周血淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增chβ2m 基因全長片段，然后將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+），轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），用IPTG對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用HiTrap親和柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。結(jié)果顯示，采用RT-PCR擴(kuò)增出chβ2m基因全長約360 bp，編碼120個氨基酸，與基因庫公布的相一致，同源性為100%；經(jīng)0.8 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)chβ2m融合蛋白主要以可溶性形式存在于細(xì)菌裂解上清；利用His標(biāo)簽純化該蛋白，SDS-PAGE分析僅見約34 kDa大小的chβ2m融合蛋白條帶；Western-blot分析表明，純化后的chβ2m融合蛋白與特異單克隆抗體反應(yīng)呈現(xiàn)特異性的條帶。以上結(jié)果證實，本研究成功表達(dá)并獲得了純化的可溶性chβ2m融合蛋白，為進(jìn)一步對chβ2m結(jié)構(gòu)及其功能研究奠定基礎(chǔ)。

β2-微球蛋白；基因克?。辉吮磉_(dá)

β2-微球蛋白（β2-microglobuli, β2m）由Berggard[1]于1968年首先從腎小管病變患者的蛋白尿中分離出來。β2m是由99個氨基酸殘基組成的小分子量非糖基化蛋白，約12 kDa[2]。所有有核細(xì)胞均能合成[3]，β2m作為主要相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）I類分子的β鏈（輕鏈），對維持MHC-I類分子天然構(gòu)型的穩(wěn)定及執(zhí)行正常的生理功能具有重要作用[4]。最近研究人員發(fā)現(xiàn)在人類腎癌、前列腺、骨髓癌等癌癥惡化過程中，β2m往往過表達(dá)[5,6]。在禽類研究方面，本實驗室對感染馬立克氏病病毒的SPF雞皮膚蛋白質(zhì)組差異表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，β2m顯著升高[7]，并且認(rèn)為其可作為腫瘤發(fā)展的重要標(biāo)志。

雞不僅可作為小動物腫瘤研究模型，并且其免疫反應(yīng)，抗病性以及疫苗反應(yīng)性均可為人類疾病控制與免疫調(diào)節(jié)奠定良好的基礎(chǔ)[8]，目前，關(guān)于雞MHC-I尤其是對雞β2m（chicken β2-microglobuli, chβ2m）研究至今仍然很少。因此，我們構(gòu)建了能高效表達(dá)chβ2m的原核表達(dá)載體，并利用該系統(tǒng)表達(dá)并純化得到大量可溶性chβ2m融合蛋白，為chβ2m的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與實驗動物大腸桿菌DH5α和原核表達(dá)宿主菌BL21（DE3）均由本室保存；pGEM-T Easy 載體購自Promega公司；pET-32a（+）原核表達(dá)載體購自Clontech 公司。

1.2 主要試劑和儀器淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma公司；DNA Marker、LATaq聚合酶和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；EcoR ?、Xho?等限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒和總RNA提取試劑盒購自Axygen公司；HiTrap親和柱購自GE公司；AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購自Sigma-Aldrich公司；BCIP/NBT Solution購自Amresco公司；LB培養(yǎng)基、2×YT培養(yǎng)基由本室配制；抗His標(biāo)簽蛋白單克隆抗體由本室制備并保存；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純；蛋白電泳儀，PTC-100 PCR儀，PAC200電泳儀均為BIO-RAD公司產(chǎn)品；4 ℃冷凍離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品；制冰機(jī)AF100AS為Scotsman公司產(chǎn)品；MiniLumi凝膠成像系統(tǒng)為DNR公司產(chǎn)品。

1.3 PCR引物的設(shè)計與合成根據(jù)已公布的雞β2-微球蛋白（GenBank: AY989898、Z48921）設(shè)計引物用于擴(kuò)增含信號肽的chβ2m CDS全長序列。上游引物P1：5'-TTGAATTCATGGG GAAGGCGGCGGC-3'；下游引物P2：5'-TTCTCGA GTCAGAACTCGGGATCCCA-3'。上游引物與下游引物中分別加入了EcoR I 和XhoI 酶切位點，引物由上海英駿生物工程公司合成。

1.4 雞外周血淋巴細(xì)胞的分離無菌采取28日齡正常雞外周血2 mL，注入含有肝素的無菌采血管中（每毫升全血含0.1 mL 肝素，即1:10稀釋），立即上下緩慢顛倒混勻，使血液抗凝；然后將抗凝血移入10 mL玻璃離心管，用吸管加入等量PBS （pH=7.2），使血液等倍稀釋；再吸取淋巴細(xì)胞分離液2 mL置于10 mL玻璃離心管中，將上述稀釋的血液在距分離液界面上1 cm處沿試管壁緩慢加至分離液表面，3000×g離心15 min，離心后，管內(nèi)分層。最后用200 μL移液槍輕輕插入灰白色淋巴細(xì)胞層，輕輕吸出該層淋巴細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)入另一個10 mL離心管中，用5倍體積的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次以2000 ×g離心10 min，棄上清，離心下的細(xì)胞即為雞外周血淋巴細(xì)胞。

1.5 總RNA的提取和cDNA的合成雞外周血淋巴細(xì)胞總RNA的提取按照Axygen小提RNA試劑盒操作說明進(jìn)行，總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA按PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.6 chβ2m基因擴(kuò)增與鑒定以設(shè)計合成的chβ2m特異性引物（P1/P2）為引物，以轉(zhuǎn)錄的雞外周血淋巴細(xì)胞cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增chβ2m基因，反應(yīng)體系為：5×PCR Buffer（含MgCl2）10 μL，dNTP 8 μL，LATaqDNA 0.5 μL，模板 1 μL，上下游引物各1 μL（20 umol/L）。然后按95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 1 min，56 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.7 重組質(zhì)粒pGEM-T-chβ2m的構(gòu)建將擴(kuò)增出的chβ2m目的條帶按照Axygen的AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化與pMD18-T-easy Vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，提取相應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將經(jīng)鑒定為陽性重組質(zhì)粒的克隆菌送上海英俊生物公司測序。

1.8 重組質(zhì)粒pET-32a-chβ2m的構(gòu)建將鑒定好的重組質(zhì)粒pGEM-T-chβ2m，經(jīng)EcoR ? 和Xho? 雙酶切后，回收約360 bp 大小的chβ2m目的片段，然后與經(jīng)相同酶切的pET-32a空載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Amp的 LB固體平板培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，提取相應(yīng)質(zhì)粒，然后用不同酶切位點進(jìn)行酶切鑒定。

1.9 chβ2m的原核表達(dá)與純化將含有pET-32achβ2m原核表達(dá)載體的重組菌搖菌過夜培養(yǎng)，然后以1:100轉(zhuǎn)接種于含Amp的2YT培養(yǎng)基中，37 ℃ 225 rpm震蕩培養(yǎng)4 h；加入IPTG（使終濃度為0.4和0.8 mmol/L）后，28 ℃ 180 rpm誘導(dǎo)6 h；誘導(dǎo)表達(dá)后，以5000×g離心5 min收集菌體，用PBS重懸后在冰上超聲裂解（振幅30 A，超聲3 min，間隔10秒）；然后用12 000×g4 ℃離心10 min，分別取上清和沉淀，用蛋白電泳buffer處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時將含有pET-32a的空載體菌按同樣方式進(jìn)行誘導(dǎo)作為對照。將含有目的蛋白的細(xì)菌裂解液上清用0.45 μm濾器過濾，然后用GE公司HiTrap親和柱進(jìn)行純化，將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢驗純化效果。

1.10 Western-blot鑒定將純化的chβ2m融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，在冰上以50 V轉(zhuǎn)印2 h到NC膜。參照文獻(xiàn)[9]報道方法，轉(zhuǎn)印后將膜放入含5 %脫脂乳的TBST中4 ℃封閉過夜或37 ℃水浴搖床封閉2 h；倒掉封閉液，加入一抗（抗His單抗和抗chβ2m單抗，抗體用含有5 %脫脂乳的TBST 1: 1000稀釋)，37 ℃水浴搖床內(nèi)作用1 h；于搖床上用TBST洗膜3次，每次5 min；加入AP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG （含5 %脫脂乳TBST 1:6000 稀釋），37 ℃作用1 h；搖床上用TBST洗膜5次，每次5 min；BCIP/NBT（BCIP/NBT與ddw 1:10稀釋）避光顯色，待出現(xiàn)特異性目的條帶時立即用水沖洗終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 chβ2m基因的擴(kuò)增與鑒定chβ2m基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖核酸電泳，結(jié)果顯示，在約360 bp左右可見特異性條帶，與預(yù)期大小相一致（圖1）。然后分別用EcoR ? 和Xho? 酶切重組質(zhì)粒pGEM-T-chβ2m后可見3000 bp T載體條帶和360 bp的目的條帶（圖2A）；進(jìn)一步用EcoR I和序列內(nèi)部酶切位點BamH I雙酶切質(zhì)粒pGEM-T-chβ2m仍然可見3000 bp T載體條帶和360 bp左右的目的條帶（圖2B）；挑取陽性菌落測序比對后發(fā)現(xiàn)，與已登錄的chβ2m序列（GenBank：M84767.1、AY989898、Z48921）相一致，同源性為100%。以上結(jié)果均說明重組質(zhì)粒pGEM-T-chβ2m構(gòu)建成功。

圖1 chβ2m的PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplif cation of chβ2m by PCR

2.2 重組質(zhì)粒pET-32a-chβ2m的酶切鑒定將重組質(zhì)粒pET-32a-chβ2m進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)EcoR I 和XhoI酶切可見6000 bp的空載體條帶和360 bp的目的條帶（圖3），進(jìn)一步用EcoR I和BamH I酶切，同樣可見6000 bp的空載體條帶和360 bp左右的目的條帶（圖3），與預(yù)期大小相一致，說明重組chβ2m的原核表達(dá)載體pET-32a-chβ2m構(gòu)建成功。

圖2 pGEM-T-chβ2m的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme analysis of pGEM-T-chβ2m plasmid

圖3 pET-32a-chβ2m的酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme analysis of pET-32a- chβ2m plasmid

2.3 融合蛋白的表達(dá)將含重組質(zhì)粒pET-32a-chβ2m的BL21（DE3）經(jīng)不同濃度的IPTG （0.4 mmol/L和0.8 mmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行 SDS-PAGE。結(jié)果如圖4顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，宿主菌表達(dá)的chβ2m融合主要以可溶性表達(dá)位于裂解上清中，在34 kDa左右可見明顯的融合蛋白條帶（與預(yù)期大小相一致），而對照組宿主菌中主要可見22 kDa左右的空載體蛋白。另外，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，0.8 mmol/L IPTG要明顯多于0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量（圖4）。

2.4 融合蛋白的純化His標(biāo)簽過柱純化后，結(jié)果顯示，在34 kDa處僅見純化的chβ2m融合蛋白，無其他雜帶，說明通過此方法可以得到較純的chβ2m融合蛋白（圖5）。

圖4 雞β2m融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.4 Expression of pET-32a-chβ2m in BL21(DE3) induced by IPTG

圖5 chβ2m融合蛋白的純化Fig.5 The purif cation of chβ2m fusion proteins

2.5 融合蛋白的鑒定利用抗His標(biāo)簽蛋白的單抗和抗β2m單抗進(jìn)行純化蛋白的Western-blot，結(jié)果顯示抗His標(biāo)簽蛋白的單抗能與His-chβ2m和His標(biāo)簽蛋白都發(fā)生特異性反應(yīng)，分別在34 kDa與20 kDa處出現(xiàn)反應(yīng)條帶（圖6A）；而抗β2m單抗只能與Hischβ2m發(fā)生特異性反應(yīng)，在34 kDa處出現(xiàn)反應(yīng)條帶，與His標(biāo)簽蛋白不反應(yīng) （圖6B），證明chβ2m融合蛋白得到了正確表達(dá)，并能與特異性的抗β2m單抗反應(yīng)。

3 討論

β2m作為MHC-I類分子復(fù)合物的輕鏈分子，可促進(jìn)抗原肽與MHC-I類分子的結(jié)合，對穩(wěn)定MHC-I類分子結(jié)構(gòu)和發(fā)揮MHC-I有效提呈抗原肽功能必不可少[10]。雖然所有有核細(xì)胞均可表達(dá)β2m，但是鑒于β2m的表達(dá)與細(xì)胞免疫水平相關(guān)，因此為了能成功克隆出特異性chβ2m全長序列，本研究在選擇克隆chβ2m模板時，以提取具有較高免疫水平雞外周血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，通過RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，本研究根據(jù)此方法成功克隆出包含信號肽在內(nèi)的chβ2m全長片段，并且電泳后顯示僅在約360 bp左右可見特異性條帶，條帶單一，具有較高的擴(kuò)增效率，可便于chβ2m進(jìn)一步的回收與克隆操作。

圖6 Western-blot 分析純化的chβ2m融合蛋白Fig.6 The purif cation of chβ2m fusion proteins

pET原核表達(dá)系統(tǒng)是目前利用大腸桿菌克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)。經(jīng)過人工改造后，pET系統(tǒng)可受噬菌體 T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制。將目的基因克隆到pET質(zhì)粒載體上后，表達(dá)可由宿主細(xì)胞提供的T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)。鑒于T7 RNA 聚合酶機(jī)制十分有效并具選擇性，在充分誘導(dǎo)時，幾乎所有細(xì)胞資源都可用于目的蛋白的表達(dá)，并且在誘導(dǎo)表達(dá)后僅數(shù)小時之內(nèi)目的蛋白就可以占到細(xì)胞總蛋白的50%以上[11]。因此，利用該系統(tǒng)很容易獲得目的蛋白的高效表達(dá)。然而不同的克隆策略、對限制性酶切位點以及閱讀框的不同要求，會影響對載體的選擇。即便不同載體表達(dá)相同蛋白也會出現(xiàn)不同的表達(dá)形式。在我國，張勁等[12]利用pET-23a表達(dá)系統(tǒng)完成了對人β2m的高效表達(dá)，而該原核系統(tǒng)表達(dá)的人β2m大部分在包涵體中。后來，張蕾等[13]去掉信號肽后利用pET-28表達(dá)人β2m成熟肽蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白可以表達(dá)在菌體包涵體、質(zhì)周腔、胞質(zhì)及培養(yǎng)上清液4個部位，可惜的是大部分蛋白仍位于包涵體中。針對雞β2m，劉光亮等[14]嘗試將雞β2m在pET28a（+）中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)去掉信號肽后可大大提高chβ2m表達(dá)量，但是表達(dá)的chβ2m成熟肽蛋白仍以包涵體形式存在。通過原核誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白，目的蛋白以包涵體形式表達(dá)雖然具有表達(dá)量高、不易被降解等優(yōu)點。然而蛋白在迅速表達(dá)形成的包涵體中，往往缺乏有效的折疊[15]，并且在后期純化需要復(fù)性過程，操作相對復(fù)雜。能夠獲得可溶性表達(dá)蛋白是最理想的選擇。在本研究中我們選擇以pET32a（+）載體在BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)雞β2m蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPTG誘導(dǎo)后chβ2m主要以可溶性形式存在，并且我們利用載體上的His標(biāo)簽通過鎳親和柱得到了較高純度的重組chβ2m蛋白。因此，以原核表達(dá)系統(tǒng)pET32a制備chβ2m是獲取該蛋白可靠、穩(wěn)定、實用的方法，并且在不丟棄信號肽的情況下仍然能夠獲得大量的可溶性蛋白，進(jìn)一步保證了該蛋白具有生物學(xué)功能的可行性研究。

總之，在本研究中我們成功克隆并表達(dá)了chβ2m重組蛋白，并且表達(dá)的chβ2m蛋白包含信號肽全長CDS功能序列，呈可溶性表達(dá)，純化后蛋白純度高，易大量獲得，可為進(jìn)一步對chβ2m結(jié)構(gòu)及其功能研究提供必要的材料。

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CLONING AND EXPRESSION OF CHICKEN β2-MICROGLOBULIN IN ESCHERICHIA COLI

XU Wen-cai1, LIU Qiu1, LI Dan1, HU Xu-ming1,2, WU Geng-hua2, QIAN Kun1,2,3, SHAO Hong-xia1,2,3, JIN Wen-jie1,2,3, QIN Ai-jian1,2,3
(1. Ministry of Education Key Lab for Avian Preventive Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2. Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009,China)

chβ2m gene was amplif ed from normal chicken peripheral blood lymphocytes by RT-PCR. It was cloned into pET-32a(+) vector and induced by IPTG, then purif ed with HiTrap aff nity column. The results showed that the sequence of chβ2m gene amplif ed from chickens by RT-PCR was the same as that previously reported (M84767, AY989898, Z48921) and consists of 360 bp encoding 120 amino acids (aa). Most of the soluble recombinant chβ2m proteins existed in the bacterial supernatant induced with 0.8 M IPTG. Only one band of molecular weight of 34 kDa was purif ed by ion-exchange chromatography. Western blotling assay demonstrated that anti-His-tag monoclonal antibody could specif cally recognize the recombinant protein. This work would provid us the basis materials for further study of the structure and functions of chβ2m.

β2-microglobulin; clone; prokaryotic expression

S858.312.42

A

1674-6422（2014）01-0063-06

2013-10-30

國家自然科學(xué)基金項目（31272560, 31072135）；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊項目（IRT0978)；江蘇省優(yōu)勢學(xué)科和江蘇省教育廳重大基礎(chǔ)研究（12KJA23001）項目資助

徐文財，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

秦愛建，E-mail：aijian@yzu.edu.cn