孫 濤，趙 寶，冉紅志，朱永周，許 敏

(陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 西安710016)

布魯氏菌病病原學(xué)研究進(jìn)展

孫 濤，趙 寶，冉紅志，朱永周，許 敏

(陜西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 西安710016)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的危害嚴(yán)重的人畜共患病，主要危害人畜生殖系統(tǒng)，患病動(dòng)物是主要的傳染源，其流行地域在不斷變化，每年都有新發(fā)和復(fù)發(fā)地區(qū)的報(bào)道。布魯氏菌的感染主要緣于其有效的宿主免疫逃避機(jī)制，論文對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外布魯氏菌抗原和毒力因子等病原學(xué)研究進(jìn)展予以綜述，為布魯氏菌病防治提供參考。

布魯氏菌病；毒力因子；病原學(xué)

布魯氏菌病是世界上危害嚴(yán)重的人畜共患傳染病之一，被OIE列為多種動(dòng)物共患病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。該病起源于公年前1600年的埃及第5次瘟疫時(shí)期，1886年David Bruce從駐守馬耳他地區(qū)的一個(gè)死于馬耳他熱的英國(guó)士兵脾臟內(nèi)分離到了病菌，后來(lái)將馬耳他熱命名為布魯氏菌病。在動(dòng)物上，布魯氏菌導(dǎo)致妊娠母畜流產(chǎn)，產(chǎn)死胎，早產(chǎn)或弱胎，公畜睪丸炎和附睪炎引發(fā)不育等。對(duì)人而言，布魯氏菌侵入機(jī)體引起變態(tài)反應(yīng)性全身病變，急性期可以治愈，慢性期患者表現(xiàn)為肝臟、脾臟及睪丸腫大，關(guān)節(jié)和脊柱強(qiáng)直，肌腱攣縮變硬等，反復(fù)發(fā)作難治愈，其引發(fā)的腦炎和心肌炎可致命。目前該病已存在和流行于世界上170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，在我國(guó)也已呈大范圍的流行態(tài)勢(shì)，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。

1 病 原

布魯氏菌病的病原是布魯氏菌(Brucella)，該菌是一種革蘭氏染色呈陰性的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，短桿菌或球狀桿菌，有莢膜，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛不能運(yùn)動(dòng)。目前是采用1985年WHO所公布的分型法[2]，按照感染動(dòng)物的不同和抗原性的差異將布魯氏菌屬分為6個(gè)種19個(gè)生物型，即羊布魯氏菌(B.melitensis，3個(gè)生物型)、牛布魯氏菌(B.abortus，8個(gè)生物型)、豬布魯氏菌(B.suis，5個(gè)生物型)、綿羊附睪布魯氏菌(B.ovis，1個(gè)生物型)、沙林鼠布魯氏菌(B.neo-tomae，1個(gè)生物型)、犬布魯氏菌(B.canis，1個(gè)生物型)。2007年Bortg等[3]從鯨魚(yú)、海豚、海豹等海洋哺乳動(dòng)物分離到鯨型布魯氏菌(B.ceti)和鰭型布魯氏菌(B.pinnipedialis)。2008年又發(fā)現(xiàn)了田鼠種布魯氏菌(B.microti)。

布魯氏菌細(xì)胞膜是一個(gè)三層膜的結(jié)構(gòu)，最內(nèi)層的膜稱(chēng)為細(xì)胞質(zhì)膜、外層膜稱(chēng)為外周胞質(zhì)膜，最外層膜稱(chēng)為外膜，外膜與聚肽糖(PG)層緊密結(jié)合組成細(xì)胞壁，外膜含有脂多糖(LPS)、蛋白質(zhì)和磷脂層?；驕y(cè)序表明，布魯氏菌種的基因組組成和大小很相似，基因組由2個(gè)環(huán)狀染色體組成，平均長(zhǎng)度大約為3.39 Mb，G+C含量占到了57.3%[4]。與其他類(lèi)細(xì)菌性病原體相比，布魯氏菌缺少常見(jiàn)的編碼質(zhì)粒、莢膜、菌毛或內(nèi)毒素的基因，因而對(duì)其寄生及胞內(nèi)復(fù)制的相關(guān)因子了解較少，造成對(duì)其在與宿主相互作用方面的研究也很有限。

2 感染機(jī)理

布魯氏菌主要通過(guò)皮膚或消化道黏膜侵入機(jī)體，隨著淋巴液的循環(huán)到達(dá)淋巴結(jié)后被巨噬細(xì)胞吞噬。由于具有先天和后天適應(yīng)性免疫逃避機(jī)制，布魯氏菌能夠抵御巨噬細(xì)胞的胞內(nèi)酸性環(huán)境，阻止吞噬溶酶體的融合，從而在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而形成局部原發(fā)性病灶。隨著感染的發(fā)展，胞內(nèi)大量增殖的菌體引發(fā)巨噬細(xì)胞死亡，從破裂的巨噬細(xì)胞中釋放出大量細(xì)菌進(jìn)入血液和淋巴液，形成菌血癥，在此期間，機(jī)體受細(xì)菌莢膜的刺激和細(xì)菌分泌的透明質(zhì)酸酶、內(nèi)毒素的侵害而在臨床上表現(xiàn)出發(fā)熱癥狀。數(shù)天后，細(xì)菌隨血液循環(huán)到達(dá)淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、生殖器官等形成多發(fā)性病灶，引發(fā)機(jī)體調(diào)動(dòng)大量巨噬細(xì)胞進(jìn)行吞噬，此后體溫逐漸恢復(fù)。隨著大量新的巨噬細(xì)胞再次死亡破裂，細(xì)菌又一次進(jìn)入血液，隨后又會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，從而出現(xiàn)臨床上的"波浪熱"現(xiàn)象。如不及時(shí)采取治療措施，會(huì)造成機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p傷[5]。

3 抗原研究

研究較多的保護(hù)性抗原有外膜蛋白(Omp)、核蛋白L7/L12、胞質(zhì)結(jié)合蛋白P39等幾類(lèi)，它們的共同特點(diǎn)是都具有較好的免疫原性以及種間高度保守性。外膜蛋白研究最多的是Omp31和Omp25兩種，前者位于外膜的最外層，可與肽聚糖形成聚合物；后者的最主要特征是保守性很強(qiáng)，在布魯氏菌各個(gè)種間相似性可達(dá)98%以上；對(duì)綿羊附睪布魯氏菌的研究表明，這兩種外膜蛋白在細(xì)菌侵入機(jī)體及巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。除此之外，構(gòu)成跨膜通道的膜孔蛋白Omp36由于具有良好的免疫原性也被人熟識(shí)。核蛋白L7/L12由Rp1L基因編碼表達(dá)，由于它在布魯氏菌屬各個(gè)種間保守性很強(qiáng)，同時(shí)又有一定的免疫原性，多用于亞單位基因苗或蛋白苗的開(kāi)發(fā)研究。曾政等[7]將獲得的布氏桿菌核蛋白L7PL12重組蛋白及pCDNA3.1-L7PL12重組質(zhì)粒分別免疫小鼠，免疫效果評(píng)價(jià)表明所構(gòu)建的布魯氏菌DNA疫苗和蛋白苗均具有誘導(dǎo)特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的能力，DNA疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)于蛋白苗，可作為潛在的布氏菌新型疫苗。Iwashkiw等[8]報(bào)道，通過(guò)空腸彎曲菌(OTase)PglB將合適的受體蛋白(AcrA)進(jìn)行N-連接蛋白糖基化修飾，形成一個(gè)新的重組糖蛋白聚合物(Y)，它和牛布魯氏菌擁有相同的多糖結(jié)構(gòu)，將其注射到小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體對(duì)感染有一定的保護(hù)作用，該思路和方法顯示出廣闊的診斷和免疫應(yīng)用前景。胞質(zhì)結(jié)合蛋白P39是公認(rèn)的羊布魯氏菌的優(yōu)勢(shì)抗原，石艷春等[9]成功構(gòu)建了表達(dá)羊布氏菌P39基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-P39，將其免疫BALB/ c小鼠，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清特異性抗體水平、細(xì)胞因子含量和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)表明，該重組質(zhì)粒能夠誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。

4 毒力因子研究

與常見(jiàn)病原菌不同，布魯氏菌不表達(dá)菌毛或內(nèi)毒素等經(jīng)典毒力因子，其毒力的強(qiáng)弱判斷標(biāo)準(zhǔn)通常是以胞內(nèi)繁殖能力和對(duì)巨噬細(xì)胞殺傷的敏感性來(lái)確定的。以此標(biāo)準(zhǔn)，利用分子遺傳學(xué)技術(shù)手段遴選到的一系列的毒力基因成為了人們的研究對(duì)象，為了解布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存與增殖機(jī)制等提供了大量有價(jià)值的信息，研究者把這些相關(guān)的基因組和蛋白組統(tǒng)稱(chēng)為“毒力組”。它包括部分外膜分子、熱休克蛋白、RNA伴侶蛋白宿主因子1(Host factor 1,HF-1)和控制脂多糖(LPS)合成的基因、Ⅳ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅳ secretion system,T4SS)基因(Virb)、超氧化物歧化酶基因(SOD)、毒力因子A基因(BvfA)、過(guò)氧化氫酶基因(Cat)等[10]。環(huán)B-1,2-葡聚糖是幫助布魯菌細(xì)胞內(nèi)寄生的一種毒力因子，通過(guò)與細(xì)胞外膜作用而抵抗吞噬體和溶酶體的融合，使包含布魯菌的吞噬體繞過(guò)溶酶體通路，從而促進(jìn)布魯菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存。O-多糖也是一種毒力因子，可幫助布魯氏菌阻止其寄生的巨噬細(xì)胞的凋亡，從而避免機(jī)體體液免疫的殺傷作用，它的缺陷突變株對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解等體液免疫敏感[11]。Ayarc等[12]對(duì)巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志物進(jìn)行研究表明，兩個(gè)分化群CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞在布魯氏菌免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，推測(cè)是因?yàn)榧せ罹奘杉?xì)胞的殺菌功能后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞所分泌的促炎性細(xì)胞因子干擾素(IFN)-γ的影響。Paolo Pasquali等[13]研究表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠降低的CD4+T細(xì)胞的有效性，并且能夠有利于控制流產(chǎn)布魯氏菌感染的進(jìn)展。Ⅳ型分泌系統(tǒng)(T4SS)是一種鞭毛特異的毒力因子，是在研究由轉(zhuǎn)座子突變的減毒株時(shí)發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)通過(guò)牛布魯氏菌(S2308)基因組計(jì)劃發(fā)現(xiàn)了其完整的啟動(dòng)子。T4SS的VirB操縱子共由12個(gè)基因組成，編碼VirB1至VirB12蛋白，這些內(nèi)膜蛋白與布魯氏菌小泡的成熟有關(guān)，是細(xì)菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞并進(jìn)行增值過(guò)程所必需的[6]。SOD和Cat通過(guò)將超氧基團(tuán)轉(zhuǎn)化為超氧化氫和氧氣，來(lái)保護(hù)細(xì)菌不受活性氧中介物的殺滅，參與活性氧中介物脫毒過(guò)程，與細(xì)菌的胞內(nèi)增值有很大關(guān)系。

5 展 望

隨著各種分子生物學(xué)、蛋白和基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)布魯氏菌抗原和毒力因子研究的不斷深入，其病原學(xué)研究必將獲得長(zhǎng)足發(fā)展，也將進(jìn)一步推動(dòng)新型高效安全疫苗的開(kāi)發(fā)工作。在此之前，研究操作簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異性高，并能區(qū)分自然感染和人工免疫的血清學(xué)鑒別診斷方法頗為急切。

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《家畜生態(tài)學(xué)報(bào)》入選中文核心期刊

北京大學(xué)圖書(shū)館《中文核心期刊要目總覽》(第六版)業(yè)已由北京大學(xué)出版社出版，《家畜生態(tài)學(xué)報(bào)》入編中文核心期刊之畜牧、動(dòng)物醫(yī)學(xué)、狩獵、蠶、蜂類(lèi)的核心期刊。

《家畜生態(tài)學(xué)報(bào)》自1980年創(chuàng)刊以來(lái)，堅(jiān)持展示家畜生態(tài)研究成果，指導(dǎo)生態(tài)牧業(yè)發(fā)展，促進(jìn)畜牧生產(chǎn)與環(huán)境和諧的辦刊宗旨，倡導(dǎo)綠色、環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的畜禽健康養(yǎng)殖理念，努力提升我國(guó)家畜生態(tài)學(xué)科研究水平，刊物質(zhì)量穩(wěn)步提高。目前該刊為中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊(中國(guó)科技核心期刊)、中國(guó)核心期刊(遴選)數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)源期刊、《中國(guó)農(nóng)業(yè)文摘-畜牧》固定引用源期刊、中國(guó)期刊網(wǎng)、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊(光盤(pán)版)固定源期刊、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院《中文科技資料·農(nóng)業(yè)》收錄源期刊。

ResearchProgressonNosetiologyofBrucellosis

SUN Tao,ZHAO Bao,RAN Hong-zhi,ZHU Yong-zhou,XU min

(ShaanxiAnimalDiseaseControlCenter,Xi'an,Shaanxi,710016)

Brucellosis is caused by the Brucella,a serious harmful zoonosis,which primarily harms human and animal reproductive system.Sick animals are the main source of infection.The geographical distribution of Brucellosis is constantly changing with new occurring or recurring cases.Brucella infection is mainly due to its effective host immune evasion mechanisms.The paper reviewed the researches on antigenic properties and virulence factors,providing a reference for the prevention and control of Brucellosis.

Brucellosis; virulence factors; nosetiology

2012-09-06，

2012-10-28

孫 濤(1965-)，男，山東濟(jì)南人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)研究工作。E-mail：stxa@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0085-03