毛浩萍，牛子長，王興業(yè)，邱燕榮

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

補骨脂酚對人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細胞中睪酮和雌二醇分泌的影響*

毛浩萍1，牛子長2，王興業(yè)1，邱燕榮1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

[目的]研究補骨脂酚對人腎上腺皮質(zhì)細胞（H295R）睪酮及雌二醇分泌的影響。[方法]實驗分為空白對照組及補骨脂酚不同濃度組，分別使用CCK-8法及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測補骨脂酚對H295R細胞活力、睪酮和雌二醇分泌的影響；同時采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法（Real-time PCR）檢測補骨脂酚對睪酮和雌二醇合成酶CYP17A1和CYP19A1 mRNA表達的影響。[結(jié)果]補骨脂酚對睪酮合成酶CYP17A1 mRNA無顯著影響，但能上調(diào)雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA含量，具有減少睪酮分泌增加雌二醇分泌的作用。[結(jié)論]補骨脂酚促進H295R細胞中雌激素的產(chǎn)生。

補骨脂酚；腎上腺皮質(zhì)細胞；睪酮；雌二醇

補骨脂為補陽類中藥，具有補腎助陽，固精縮尿，暖脾止瀉，納氣平喘的功效。中醫(yī)臨床主要用于腎陽不足，命門火衰，腰膝冷痛，脾腎陽虛，泄瀉及腎不納氣的虛喘等癥的治療?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)補骨脂含有多種活性成分，包括香豆素類、黃酮類、單萜酚類及尿嘧啶、豆甾醇類化合物等[1-3]。補骨脂酚是補骨脂中一個含量較高的單萜酚類化合物，補骨脂酚在補骨脂中含量較高，約為1%～7%。研究顯示補骨脂酚具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤及肝保護等作用[4-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂酚具有植物雌激素樣作用，能劑量依賴性激活雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ），且對ERβ表現(xiàn)出很強的選擇性[8]。同時，也發(fā)現(xiàn)補骨脂酚能雙向調(diào)節(jié)牛腎上腺髓質(zhì)細胞兒茶酚胺分泌，提示補骨脂酚可能具有抗抑郁樣作用[9]。補骨脂酚經(jīng)由雄激素受體抑制雄激素依賴的前列腺癌細胞增殖[10]。腎上腺皮質(zhì)中，酶CYP19A1能催化睪酮生成雌激素雌二醇[11]。補骨脂酚是否能調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)中雌激素的分泌未見相關(guān)報道。因此，本研究使用人腎上腺皮質(zhì)癌H295R細胞，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)法（Real-time PCR）檢測補骨脂酚對H295R細胞中睪酮和雌二醇分泌及上述類固醇激素合成的催化酶mRNA含量的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 H295R細胞購自ATCC（美國），補骨脂酚由本課題組自補骨脂中提取分離，經(jīng)高效液相色譜法分析其中補骨脂酚純度大于97%?；A(chǔ)培養(yǎng)液DMEM/F12（Gibco，美國），雙抗（75 U/mL青霉素，75 μg/mg鏈霉素，Hyclone），Ⅳ組分無血清培養(yǎng)物（Nu-serumⅣ）及胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉（ITS）細胞培養(yǎng)補充物購自BD公司，0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國），細胞活力試劑盒（CCK-8）（日本同仁公司），睪酮及雌二醇ELISA檢測試劑盒購自DRG，cDNA合成試劑盒（TaqMan Reverse Transcription Rengents）購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購自羅氏。CYP17A1 ANP mRNA引物序列：AGCCGCACACC AACTATCAG（上游），TCACCGATG CTGGAGTCAAC（下游）；CYP19A1 mRNA引物序列：AGGTGCTAT TTGTCATCTGCTC（上游），TGGTG GAATCGGGTCT TTATGG（下游）；人GAPDH mRNA引物序列：AGGT CGGAGTCAACGGATTTGG（上游），GCTCCTGGAAG ATGGTGATGGG（下游）。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞完全培養(yǎng)：全培基含97.5%的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，2.5%無血清培養(yǎng)物Nu-serum IV及0.1%的ITS細胞培養(yǎng)補充物。H295R細胞株培養(yǎng)于上述完全培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每4～5 d按1∶4傳代1次。每周換液2～3次。取對數(shù)生長期、生長良好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 實驗分組 H295R細胞胰酶消化后使用完全培養(yǎng)基種于24孔板或12孔板中。24 h后分為對照組及補骨脂酚10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5mol/L濃度組。

1.4 補骨脂酚對H295R細胞活性的影響 調(diào)整細胞濃度為105個/mL種于96孔板中，24 h后細胞加入不同濃度的補骨脂酚（終濃度為10-7、3×10-7、10-6、3×10-6、10-5mol/L）孵育24 h。棄上清，加入CCK-8（終濃度V∶V 1∶10）孵育0.5 h后，450 nm處測定吸光值。

1.5 細胞分泌的睪酮和雌二醇含量的檢測 調(diào)整細胞濃度為106個/mL，種于12孔板中過夜，根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果選擇對細胞活性無顯著變化的補骨脂酚濃度（終濃度為10-7、3×10-7、10-6mol/L）孵育24 h。1 000 r/min離心5 min后取細胞上清按ELISA試劑盒說明檢測睪酮和雌二醇含量。

1.6 Real-time PCR法檢測CYP17A1和CYP19A1 mRNA含量 調(diào)整細胞濃度為106個/mL，種于12孔板中過夜，根據(jù)CCK-8實驗結(jié)果選擇對細胞活性無顯著變化的補骨脂酚濃度（終濃度為10-7，3×10-7、10-6mol/L）孵育24 h。1 000 r/min離心5 min后棄上清，提取細胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴增試劑盒操作進行Real-time PCR實驗。擴增反應(yīng)條件為：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min,40個循環(huán)。循環(huán)擴增結(jié)束后，記錄各組Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt法計算各組相對mRNA含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 18.0軟件包進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用單因素方差，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補骨脂酚對H295R細胞活性的影響 與空白對照組相比，3×10-6、10-5mol/L補骨脂酚顯著抑制H295R細胞活性（P＜0.01）；10-7、3×10-7、10-6mol/L補骨脂酚孵育24 h對H295R細胞活性無顯著影響，見表1。因此，選擇使用10-7、3×10-7、10－6mol/L補骨脂酚進行后續(xù)實驗。

2.2 補骨脂酚對H295R細胞中睪酮和雌二醇分泌的影響 與空白對照組比較，補骨脂酚（10-7、3×10-7、 10-6mol/L）顯著抑制H295R細胞中睪酮分泌（P＜0.01），見表2。與空白對照組相比，補骨脂酚（3×10-7、10-6mol/L）顯著促進H295R細胞中雌二醇分泌（P＜0.01），見表2。

表1 補骨脂酚對H295R細胞增殖的影響（±s）

表1 補骨脂酚對H295R細胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組相比，**P＜0.01。n=3，重復(fù)3次，結(jié)果趨勢一致。

組別 濃度（mol/L） 吸光值空白對照組- 0.259 2±0.019 2補骨脂酚 3×10-70.244 7±0.012 9 3×10-70.241 7±0.012 9 3×10-60.235 8±0.028 9 3×10-60.208 6±0.018 9** 3×10-50.122 6±0.019 1**

表2 補骨脂酚對H295R細胞睪酮和雌二醇分泌的影響（±s） %

表2 補骨脂酚對H295R細胞睪酮和雌二醇分泌的影響（±s） %

注：與空白對照組相比，**P＜0.01。n=3，結(jié)果重復(fù)3次，趨勢一致。

組別 濃度（mol/L） 睪酮 雌二醇空白對照組- 100.00±7.96 100.00±16.33補骨脂酚 3×10-7080.81±9.81** 109.53±19.02 3×10-7064.78±4.01** 126.92±10.07** 3×10-6060.11±7.04** 138.62±17.77**

2.3 補骨脂酚對 H295R細胞中 CYP17A1和CYP19A1mRNA表達的影響 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，補骨脂酚（10-7、3×10-7、10-6mol/L）對H295R細胞中CYP17A1mRNA表達無顯著影響。與空白對照組相比，補骨脂酚（3×10-7、10-6mol/L）顯著上調(diào)H295R細胞中CYP19A1 mRNA表達（P＜0.01），見表3。

表3 補骨脂酚對H295R細胞CYP17A1和CYP19A1mRNA表達的影響（±s）

表3 補骨脂酚對H295R細胞CYP17A1和CYP19A1mRNA表達的影響（±s）

注：與空白對照組相比，**P＜0.01。n=3，結(jié)果重復(fù)3次，趨勢一致。

組別 濃度（mol/L） CYP17A1 mRNA CYP19A1 mRNA空白對照組- 1.00±0.10 1.01±0.17補骨脂酚 10-71.02±0.02 1.01±0.09 3×10-70.94±0.06 1.52±0.09** 10-61.01±0.02 2.02±0.46**

3 討論

H295R細胞來源于人腎上腺皮質(zhì)瘤，它具有上皮細胞的形態(tài)，呈單層貼壁生長。所有類固醇激素合成過程必需的催化酶均在H295R細胞中有表達，因而H295R細胞具有分泌各種腎上腺皮質(zhì)激素的特性，如能分泌孕激素、雄激素、雌激素、糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素等[12]。同時它對有毒物質(zhì)的反應(yīng)水平與正常的人腎上腺細胞對有毒物質(zhì)的反應(yīng)水平相比是一致的。因此，H295R細胞系成為了體外篩選具有調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)類固醇激素作用相關(guān)藥物的有力工具[13]，同時也為體外研究藥物調(diào)節(jié)類固醇激素分泌的作用機制提供了可能。

腎上腺皮質(zhì)能分泌包括鹽皮質(zhì)類固醇、糖皮質(zhì)激素類固醇以及腎上腺性激素等多種調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝相關(guān)的激素，參與機體對一切有害刺激的應(yīng)激反應(yīng)。腎上腺皮質(zhì)中的各種皮質(zhì)類固醇激素均由統(tǒng)一的前體膽固醇在不同合成酶的催化下合成而來。研究顯示腎上腺皮質(zhì)中的雄性激素睪酮能在酶CYP19A1的催化下生成雌二醇。正常生理條件下，腎上腺皮質(zhì)并非是雌激素的直接重要來源。但是，婦女進入更年期后卵巢功能逐步衰退導(dǎo)致體內(nèi)雌二醇水平急劇下降，此時從腎上腺皮質(zhì)雄激素轉(zhuǎn)化而來的雌二醇是絕經(jīng)期后婦女體內(nèi)雌二醇的主要來源。研究顯示補骨脂中多種成分具有類雌激素樣作用[14-15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂中補骨脂酚具有類雌激素樣作用，當前研究顯示補骨脂酚顯著抑制H295R細胞中睪酮分泌，同時促進細胞雌二醇分泌。檢測上述兩種類固醇激素合成酶CYP17A1和CYP19A1 mRNA含量發(fā)現(xiàn)，補骨脂酚對睪酮合成的催化酶CYP17A1 mRNA水平無明顯影響，顯著提高雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA，提示補骨脂酚調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)中雌性激素分泌的作用可能與調(diào)節(jié)雌二醇合成酶CYP19A1 mRNA水平有關(guān)，這與補骨脂改善初老小鼠體內(nèi)雌孕激素水平等作用的報道是一致的[16]。

雌激素尤其是17β-雌二醇是許多靶組織生長、分化以及行使生物學(xué)功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究顯示雌激素具有降血脂、抗氧化、保護內(nèi)皮、抑制血管平滑肌細胞增殖等活性，雌激素還能調(diào)節(jié)CA類神經(jīng)遞質(zhì)的合成、分泌及重吸收，從而具有心血管保護、抗抑郁等作用[17-18]。課題組研究發(fā)現(xiàn)補骨脂酚能顯著促進腎上腺皮質(zhì)中的雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，從而上調(diào)雌激素的分泌水平，課題組以往的研究也發(fā)現(xiàn)補骨脂酚具有潛在的抗抑郁樣作用[6]，其作用是否與補骨脂酚調(diào)節(jié)腎上腺皮質(zhì)細胞中雌性激素分泌有關(guān)仍有待于進一步研究。

[1]辛 丹，顏冬梅，王躍飛，等.補骨脂及其相關(guān)化學(xué)成分的藥理與毒理研究進展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，11（7）：70-72.

[2]熊 文，彭四威，劉海濤，等.補骨脂不同提取工藝的比較研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，32（2）：98-100.

[3]郭錦明，劉亞男，王躍飛，等.制備高效液相色譜法分離補骨脂中的補骨脂苷和異補骨脂苷[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009,28（3）：136-137.

[4]陳紅莉，馮慧瑾，李援朝.補骨脂酚的體外抗腫瘤活性及其關(guān)鍵中間體的合成研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2010，45（4）：467-470.

[5] Park EJ，Zhao YZ,Kim YC,et al.Protective effect of(s)-bakuchiol from Psoralea corylifolia on rat liver injury in vitro and in vivo[J].Planta Med,2005,71(6):508-513.

[6] Kim KA,Shim SH,Ahn HR,et al.Protective effects of the compounds isolated from the seed of Psoralea corylifolia on oxidativestress-inducedretinaldamage[J].ToxicolApplPharmacol, 2013,269(2):109–120.

[7] ChoiSY,LeeS,ChoiWH,etal.Isolationandanti-inflammatory activity of bakuchiol from Ulmus davidiana var.japonica[J].J Med Food,2010,13(4):1019-1023.

[8] Xin D,Wang H,Yang J,et al.Phytoestrogens from Psoralea corylifolia reveal estrogen receptor-subtype selectivity[J].Phytomedicine,2010,17(2):26-131.

[9] Mao HP,Wang H,Ma SW,et al.Bidirectional regulation of bakuchiol,an estrogenic-like compound,on catecholamine secretion[J].Toxicol Appl Pharmacol,2014,274(1):180-189.

[10]苗 琳，馬尚偉，樊官偉，等.補骨脂酚拮抗AR轉(zhuǎn)錄活性抑制雄激素誘導(dǎo)的前列腺癌細胞LNCaP的增殖[J].天津中醫(yī)藥，2013，30（5）：291-293.

[11]Caroline F,Doreen N,Shewit K,et al.An in vitro investigation of endocrine disrupting effects of the mycotoxin alternariol[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2013,271:64-71.

[12]Pagotto RM,Pereyra EN,Monzon C,et al.Histamine inhibits adrenocorticalcellproliferation butdoes notaffect steroidogenesis[J].J Endocrinol,2014,221(1):15-28.

[13]Wiebke P,Petra N,Eberhard H.Effects of single pesticides and binary pesticide mixtures on estrone production in H295R cells[J].Arch Toxicol,2013,87(12):2201-2214.

[14]韋妍妍，張紫佳，徐 穎，等.補骨脂對去卵巢大鼠雌激素樣作用研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011,17（13）: 158-161.

[15]壽清耀，楊榮平，王賓豪，等.補骨脂雌激素樣作用的有效成分研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2007,18（6）：425-427.

[16]巴文君，孫麗萍，張秋菊，等.補骨脂對初老小鼠體內(nèi)雌孕激素水平作用實驗研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2010,38（5）：19-22.

[17]Nobuyuki Yanagihara,Minhui Liu,Yumiko Toyohira.Stimulation of catecholamine synthesis through unique estrogen receptors in the bovine adrenomedullary plasmamembrane by 17β-estradiol[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006,339:548-553.

[18]郭 潔,宋殿榮.補骨脂香豆素成分研究進展[J].天津中醫(yī)藥,2013,30(4):250-253.

Effects of bakuchiol on secretion of testosterone and estradiol from H295R cells in human with carcinoma of adrenal cortex

MAO Hao-ping1,NIU Zi-chang2,WANG Xing-ye1,QIU Yan-rong1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

[Objective]To study the effects of bakuchiol on testosterone and estradiol secretion from H295R cells.[Methods]The researches were divided into control group and bakuchiol groups.The effects of bakuchiol on cellular activites and the secretion of testosterone and estradiol were detected by CCK-8 method and ELISA method.The levels of CYP17A1 and CYP19A1 mRNA were also detected by Real-time PCR.[Results]Bakuchiol could not affect CYP17A1 mRNA leverl but could up-regulate CYP19A1 mRNA.Bakuchiol had the effect of decreasing the secretion of testosterone but increasing the secretion of estradiol.[Conclusion]Bakuchiol can stimulate estradiol secretion from H295R cells.

bakuchiol；H295R cell；testosterone；estradiol

R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0347-04

2014-07-10）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.08

國家自然科學(xué)基金項目（81303247）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金項目（20121210120009）。

毛浩萍（1983-），女，助理研究員，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

牛子長，E-mail:haoping_mao@126.com。