劉 超，蘇龍翔，方向群，劉長庭

解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853

銅綠假單胞菌LCT-PA220菌株全基因組序列測定與分析

劉 超，蘇龍翔，方向群，劉長庭

解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853

目的 全基因組測序和分析銅綠假單胞菌LCT-PA220菌株，研究空間因素對細菌全基因組的影響，為宇航員的保健奠定基礎。方法通過革蘭染色鑒定LCT-PA220屬性，提取基因DNA、構建文庫并上機測序；加工處理原始測序數(shù)據(jù)后進行基因組組裝、注釋和分析。結果銅綠假單胞菌LCT-PA220菌株革蘭染色陰性，基因組為6.87M，包括5 829個編碼序列，平均長度為962 bp，預測到為54個tRNA基因，COG數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫比對共注釋到22組COG功能和32條KEGG信號通路。結論銅綠假單胞菌LCT-PA220菌株全基因組測序和基因組清楚，為后續(xù)對該菌株的研究打下了基礎。

銅綠假單胞菌；基因組；測序；編碼序列

銅綠假單胞菌，即綠膿桿菌，是一種非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，菌體細長且長短不一[1]。它存在于土壤、水、皮膚、呼吸道和腸道等，在自然環(huán)境中廣泛分布，尤其是在潮濕的環(huán)境中，可引起人類和動物的疾病，是人類和動物的條件致病菌[2]。免疫力低下(長期使用激素類藥物、免疫抑制劑、實行腫瘤放療、化療治療)、侵入性診療操作(氣管切開、保留導尿管等)或手術后的病人易受該菌感染，因此其常被認為是醫(yī)院內感染的重要病原菌之一[3-4]。隨著生物信息學和新一代測序技術的發(fā)展，細菌的基因組研究日趨廣泛，為快速研究致病菌株的致病和耐藥機制提供了有效的手段[5]。本研究分析了一株銅綠假單胞菌菌株的全基因組測序結果，為更好地了解該菌株的各種生物學特性提供了一定的理論基礎。

材料方法

1 主要材料 LCT-PA220來自中國菌種保存中心CGMCC1.2387經過系列溫度培養(yǎng)的分離株，SOAPdenovo組裝軟件工具(華大基因)、高通量測序儀Illumina HiSeq 2000(Illumina公司)。

2 銅綠假單胞菌LCT-PA220菌株的培養(yǎng)和革蘭染色 取出凍存好的銅綠假單胞菌進行平板劃線培養(yǎng)，第2天挑取單克隆菌類，接種至LB培養(yǎng)中30℃培養(yǎng)24 h。取50 μl菌液離心，棄上清，加入無菌水50 μl，吸取20 μl于載玻片上進行固定；加入革蘭染色Ⅰ(結晶紫)初染1 min，自來水沖洗后加入革蘭染色Ⅱ(碘液)媒染1 min，沖洗后加入革蘭染色Ⅲ(酒精)脫色30 s，沖洗后加入革蘭染色Ⅳ(番紅)復染1 min，沖洗晾干后用油鏡(100×)進行觀察。

3 LCT-PA220菌株的基因組DNA提取和測序文庫構建 通過裂解細菌、抽提、沉淀等步驟獲得基因組DNA，采用超聲將DNA打斷，再將接頭連接到片段上，經PCR擴增后制成測序文庫，隨后將已加入接頭的DNA片段固定在Flow cell上，經PCR擴增反應形成Cluster。然后利用4種熒光標記的染料邊合成邊測序。

4 LCT-PA220菌株基因組DNA的組裝和基因預測分析 原始測序數(shù)據(jù)下機后，經過過濾去除污染、重復和接頭序列，得到用于組裝和分析的Clean數(shù)據(jù)，運用華大自主開發(fā)的SOAP denovo組裝軟件對Reads數(shù)據(jù)進行組裝，最終組裝成全基因組序列。采用Glimmer3.0軟件預測基因：通過與rRNA庫比對找到rRNA，或rRNAmmer軟件預測rRNA。通過tRNAscan軟件預測tRNA區(qū)域和tRNA的二級結構[6-9]。

5 基因的注釋和功能分析 將編碼基因的蛋白質序列與各功能數(shù)據(jù)庫進行比對(包括KEGG和COG數(shù)據(jù)庫)，得到相應基因的功能注釋信息。根據(jù)每個編碼序列的比對結果，為了保證其生物意義，以比對效果最好的結果為此條基因的注釋。此外，還將測序得到的序列同銅綠假單胞菌的質粒數(shù)據(jù)庫進行了比對。

結 果

1 LCT-PA220菌株的革蘭染色 革蘭染色法是細菌學研究中常用的一種鑒別染色法。由于與周圍環(huán)境折光率差別異同，未經染色的細菌在顯微鏡下不易觀察，染色后細菌與周圍環(huán)境差異明顯，可清晰地觀察到細菌的形態(tài)、排列及某些結構特征。LCT-PA220菌株革蘭染色呈現(xiàn)為革蘭陰性桿狀細菌，呈單個排列，無芽孢。見圖1。

2 基因的組裝和預測 使用Illumina的Genome AnalyzerⅡ進行測序并用SOAP denovo軟件行組裝，組裝結果見表1；最終得到211個Conntigs和39個Scaffolds。G+C含量被確定為66.17%，估計菌株LCT-PA220基因組大小為6.87 M，共預測到5 829個開放閱讀框，平均長度為962 bp，編碼序列的長度分布見圖2。tRNAscan-SE軟件，預測到為54個拷貝的tRNA基因。5S、16S和23S rRNA的鑒定使用RNAmmer軟件，總長度分別為114 bp、1 523 bp和2 888 bp。

3 基因功能的注釋和分析 將預測后的開放讀碼框的蛋白序列同各數(shù)據(jù)庫比對注釋后，發(fā)現(xiàn)3 904個編碼序列匹配到了22組COG的功能中，分別有2 929和3 807個CDS可分配到Swissprot和 KEGG數(shù)據(jù)庫。使用銅綠假單胞菌PAO1(accession No.NC_002516.2)作為參考的基因組序列進行比較基因組分析。用SOAP比對軟件分析可知所有Reads均能夠比對上PAO1基因組，有大約95%的基因組覆蓋率和-120X的基因組覆蓋深度(圖3、圖4)。因此PAO1總基因長度的95%覆蓋了我們的Reads。同時使用SOAPaligner發(fā)現(xiàn)了4個銅綠假單胞菌質粒(NC_008357，NC_009739，NC_010722和NC_007100)。但是，所有4個質粒的基因組覆蓋率均＜10%。來自假單胞菌的質粒CT14(accession No NC_010891)覆蓋度超過31%，覆蓋區(qū)域是由兩個片段組成，覆蓋深度為120X，表明這兩個片段可能源于此質粒并整合到了該菌株的基因組中。

4 GenBank登錄號 銅綠假單胞菌LCT-PA220菌株的全基因組序列存儲在DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為AJKG00000000。

表1 LCT-PA220菌株基因組DNA測序數(shù)據(jù)的組裝結果統(tǒng)計表Tab. 1 Summary of assembly of LCT-PA220 genome

討 論

隨著人類基因組計劃的實施和進行，生物體基因組研究已經成為生命科學研究的前沿領域，而與之相對應的微生物基因組研究正在廣泛開展[5]。細菌是微生物的一種，其基因組小、操作簡單且實驗周期短，其研究的工作可為人類基因組研究提供有益的參考；同時隨著測序技術的更新?lián)Q代和高通量測序技術的出現(xiàn)，細菌基因組的測序成本和所需時間已大幅度降低[10]。通過基因組研究揭示細菌的遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)關鍵的功能基因并在此基礎上發(fā)展疫苗，開發(fā)新型的抗菌藥物或新的快速診斷方法，特別是針對某些新型傳染性病原菌的全基因組測序研究，對人類的醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)影響巨大[11]。

圖 1 LCT-PA220 菌株革蘭染色結果 (1 000×)Fig. 1 Gram staining of LCT-EF220 (1 000×)

圖 2 LCT-PA220菌株的基因長度分布圖Fig. 2 Gene length distribution of LCT-PA220 strain

圖 3 LCT-PA220菌株的COG功能分類圖Fig. 3 COG function classifcation of genes in LCT-PA220 strain

圖 4 LCT-PA220菌株的KEGG代謝通路分類圖Fig. 4 KEGG pathway classifcation of genes in LCT-PA220 strain

銅綠假單胞菌是臨床上一種常見的醫(yī)院內獲得性感染的機會性致病菌。其常存在于潮濕環(huán)境中，如人體呼吸道、泌尿道、消化道、傷口等處，在各種常用的醫(yī)療設備如呼吸機、導管等處也被檢測到。隨著有創(chuàng)性診療手段的推廣和大量抗菌藥物的使用，銅綠假單胞菌的感染已經上升至院內革蘭陰性桿菌感染的第一位[2-3,12]。此外，國外研究尚無針對實際空間環(huán)境下的銅綠假單胞菌的全基因組測序，本研究對常見的銅綠假單胞菌衍生株LCT-PA220的全基因測序和分析，包括5 829個開放性讀碼框，功能基因的注釋分析發(fā)現(xiàn)大部分編碼序列都能比對上COG和KEGG數(shù)據(jù)庫，KEGG代謝通路分析以感知外界環(huán)境和代謝相關的信號通路居多，COG功能分析發(fā)現(xiàn)大部分基因是參與生命的代謝活動，還有一部分功能未知。通過對該菌株的基因組研究，希望能揭示銅綠假單胞菌致病的遺傳規(guī)律，為后續(xù)的功能基因組研究提供一些啟示。

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Whole genome sequencing and analysis of Pseudomonas aeruginosa strain LCT-PA220

LIU Chao, SU Long-xiang, FANG Xiang-qun, LIU Chang-ting
Respiratory Diseases Department in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

LIU Chang-ting. Email：liuchangt@gmail.com

ObjectiveTo study the influence of the spatial factor which is closely associated with spacemen's health, the whole genome sequence of Pseudomonas aeruginosa strain LCT-PA220.MethodsThe characteristic was identified by gram stain examination. Then genomic DNA was extracted from LCT-PA220 strain and the library was constructed and followed by sequencing. The raw date were fltered, assembled into genome, annotated and analyzed.ResultsThe identify of LCT-PA220 strain was gram-negative bacteria whose genome was 6.87M containing 54 tRNA genes and 5 829 coding sequences with 962 bp average gene length. COG and KEGG annotation analysis revealed 22 COG functions and 32 KEGG pathways, respectively.ConclusionThe whole genome of LCT-PA220 strain is sequenced and annotated well, which paves the way for further study of this strain.

Pseudomonas aeruginosa; genome; sequencing; coding sequence

R 378

A

2095-5227(2014)07-0738-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.025

時間：2014-03-20 15:01

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140320.1501.006.html

2014-01-16

國家“973”重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(2014CB744400)；全軍醫(yī)學科研“十二五”課題重點項目(BWS12J046)；武器預研重點基金(9140A26040312JB10078)

Supported by National “973” Program for Basic Science Research Development of China(2014CB744400); the Military Special-purpose Program of "Twelfth Five-Year"(BWS12J046)

劉超，男，碩士。研究方向：老年呼吸病學，微生物學。Email：c6663619@163.com

劉長庭，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，主任。Email：liuchangt@gmail.com