王月靜，劉曉露，李富興，韓言秀，張 莉

遼寧醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001

鋅對辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化ERK表達和熱痛閾的影響

王月靜，劉曉露，李富興，韓言秀，張 莉

遼寧醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，遼寧錦州 121001

目的研究鋅對辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化(p)的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal-regulate kinase，ERK)表達和熱痛閾的影響。方法72只C57/BL6小鼠隨機分為4組，采用足底注射辣椒素(0.5%，5 μl)制備神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)動物模型：對照組(Con)鋅飼料30 mg/(kg·d)喂養(yǎng)2周后足底注射溶劑(吐溫80、酒精和0.9%氯化鈉注射液混合液)；N-NPP組鋅飼料30 mg/(kg·d)喂養(yǎng)2周后給予足底注射辣椒素，L-NPP組鋅飼料0.85 mg/(kg·d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素，H-NPP組硫酸鋅水溶液227 mg/(L·d)喂養(yǎng)2周后注射辣椒素。應(yīng)用動物行為學(xué)檢測、免疫組織化學(xué)、免疫印跡和圖像分析技術(shù)檢測注射后7 d鋅對動物行為學(xué)以及脊髓pERK表達的影響。結(jié)果高鋅喂養(yǎng)能顯著降低脊髓pERK的表達，降低痛敏，使熱痛閾增高(P＜0.01)；而低鋅喂養(yǎng)能增加脊髓pERK的表達，增加痛敏，使熱痛閾降低(P＜0.01)。結(jié)論鋅能抑制辣椒素致痛模型小鼠脊髓pERK的表達和熱痛覺過敏。

鋅；神經(jīng)病理性疼痛；脊髓；磷酸化；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathy pain，NPP)是由于軀體感覺系統(tǒng)損傷或疾病引起的慢性疼痛。NPP患者的主要臨床特征表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、感覺缺失、痛覺過敏和觸誘發(fā)痛等，給患者帶來極大的痛苦，嚴重影響其生活質(zhì)量[1-2]。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulating kinase，ERK)激活是NPP的重要發(fā)病機制之一，在眾多疼痛模型中均發(fā)現(xiàn)ERK磷酸化水平上調(diào)，因此其也經(jīng)常作為檢測痛敏的一個重要指標[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，鋅與NPP的產(chǎn)生與傳導(dǎo)密切相關(guān)，但其具體機制尚不清楚[5-6]。本研究利用動物行為學(xué)檢測、免疫組化、免疫印跡和圖像分析技術(shù)，觀察鋅對辣椒素致痛模型脊髓pERK表達以及動物行為學(xué)的影響，為進一步揭示鋅影響NPP的機制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

材料和方法

1 動物分組與模型制備 72只C57/BL6小鼠隨機分4組：采用左后足足底注射辣椒素(0.5%，5 μl)制備NPP模型。1)對照組：正常動物足底注射溶劑(吐溫80、乙醇和0.9%氯化鈉注射液混合液)；2)N-NPP組：適鋅飼料[鋅：30.0 mg/(kg·d)]喂養(yǎng)2周后注射辣椒素；3)L-NPP組：低鋅喂養(yǎng)[鋅：0.85 mg/ (kg·d)]2周后注射辣椒素；4)H-NPP組：高鋅喂養(yǎng)[飲用硫酸鋅水溶液，227 mg/(L·d)]2周后注射辣椒素。

2 主要試劑與儀器 兔抗小鼠多克隆pERK抗體和山羊抗兔IgG多克隆抗體購自Cell Signaling公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒和DAB染色劑購自福州邁新公司；GAPDH鼠單克隆抗體購自康成生物公司；辣椒素、ECL試劑盒和膠片購自Santa公司；PVDF膜和蛋白Marker購自NEB公司；光學(xué)顯微鏡和計算機圖像分析系統(tǒng)等。

3 取材與標本制備 足底注射辣椒素后第7天，將各組小鼠經(jīng)4%硫噴妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉后，取腰5節(jié)段脊髓，一部分稱重后，-80℃保存，用于免疫印跡檢測；一部分經(jīng)4%多聚甲醛固定12 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備5 μm厚的石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。

4 免疫組織化學(xué)染色檢測pERK在脊髓的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)。3% H2O2孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；正常非免疫動物血清孵育10 min；兔抗小鼠多克隆pERK抗體(1∶200)，4℃孵育過夜；PBS沖洗，5 min×3次；山羊抗兔IgG(1∶200)室溫下孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；鏈霉素抗生物素-過氧化物酶孵育10 min；PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色5 min，常規(guī)脫水、透明和封片，光鏡下觀察。用正常非免疫動物血清代替一抗作為陰性對照。

5 免疫印跡技術(shù)檢測pERK在脊髓的表達 脊髓組織稱重后剪碎，加入裂解液，進行超聲波粉碎，4℃過夜，低溫離心取上清液。測蛋白濃度，沸水浴煮5 min，離心備用。制備分離膠，加樣，SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，染膜，封閉，加一抗：兔抗小鼠多克隆pERK抗體(1∶500) 4℃孵育過夜，TBST漂洗，5 min×3次，加二抗(山羊抗兔IgG，1∶5 000)孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL發(fā)光，X線片曝光、顯影、定影，計算機圖像分析。

6 動物行為學(xué)觀察 從注射辣椒素前2 d開始，每天觀察小鼠的行為學(xué)變化，觀察有無跛行、注射側(cè)后足不敢著地負重、舔足、咬足、足部畸形、自噬、離地時間延長等現(xiàn)象，一直觀察到注射辣椒素后第7天。

7 熱痛覺過敏實驗 將小鼠放在一塊透明的玻璃板上，四周用透明的玻璃封閉，等小鼠對周圍的環(huán)境適應(yīng)之后再進行檢測。在玻璃板的底部，將光源照射在小鼠注射辣椒素側(cè)的后足足底所接觸的玻璃板上，記錄從照射開始到小鼠出現(xiàn)抬足或甩足的時間，每只小鼠觀察3次，每次間隔5 min，計算平均值作為熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，即熱痛閾[7]。記錄注射辣椒素前2 d和注射后第7天的痛閾。

8 圖像分析pERK在脊髓的表達 用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對免疫組化和免疫印跡結(jié)果進行圖像分析。每個樣本選取5張切片，每張切片于400倍光鏡下系統(tǒng)隨機選取3個視野進行檢測，計算平均光密度值(average optical，AO)。

9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)用表示，采用單因素方差分析(ANOVA)方法進行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠行為學(xué)變化 足底注射辣椒素后第1天即表現(xiàn)出傷側(cè)腳趾外翻并攏，走路費力甚至出現(xiàn)跛行，患肢不能抬起也不敢著地，最常見的狀態(tài)是患足懸空而立并縮至腹部，有時還會出現(xiàn)舔舐患肢及甩足的情況，小鼠明顯不如注射之前活躍，此種行為持續(xù)到檢測期末。其中，低鋅喂養(yǎng)(L-NPP)組小鼠跛行、舔足、甩足和不敢負重等現(xiàn)象最為嚴重，而高鋅喂養(yǎng)(H-NPP)組小鼠的行為學(xué)改變最輕。熱痛閾檢測顯示：與注射辣椒素前相比，各組動物注射辣椒素后7 d的痛敏增強，熱刺激縮足反射潛伏期均顯著降低。其中，L-NPP組最低，H-NPP組最高(P＜0.01)。見圖1。

圖 1 各-組小鼠注射辣椒素前后熱刺激縮足反射潛伏期比較(n=24, x±s, s)(a P＜0.01，與注射前比較；b P＜0.01，各組間比較)Fig. 1 Com par-ison of therm al withdraw al latency in each group (n=24, x±s, s)(a P＜0.01, vs before injection; b P＜0.01 vs each group)

2 pERK免疫組化陽性表達比較 pERK免疫組織化學(xué)陽性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀，主要表達在脊髓神經(jīng)元的細胞核上。對照組動物在脊髓后角淺層有少量的陽性表達產(chǎn)物，陽性細胞較少。與對照組相比，其他3組NPP動物的pERK陽性表達均增多，陽性細胞密集，平均光密度值增高(P＜0.01)。其中，L-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最密集，AO值最高；H-NPP組的陽性顆粒和陽性細胞最稀疏，AO值最低(P＜0.01)。見圖2、圖3。

3 pERK免疫印跡比較 免疫印跡技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，各組動物都顯示有pERK蛋白的條帶。與對照組相比，其他3組NPP動物的pERK蛋白陽性表達均增多。其中，L-NPP組的表達最多，H-NPP組的表達最低。見圖4、圖5。

圖 2 pERK在各組動物脊髓的表達(免疫組織化學(xué))(×400) A： 對照組； B： 正常喂養(yǎng)的NPP組； C： 低鋅喂養(yǎng)的NPP組；D： 高鋅喂養(yǎng)的NPP組Fig. 2 Immunohistochem istry show ing expression of pERK in spinal cord of control group (A), N-NPP group (B)，L-NPP group (C), and H-NPP group (D) (×400)

圖 3 各組小鼠脊髓p ERK表達的平均光密度(n=24， )(a P＜0.01，各組間比較)Fig. 3 Average optical of pERK expression in model m ice spinal cord of each group (n=24，?)(a P＜0.01, vs each other group)

圖 4 免疫印跡檢測pERK在各組模型動物脊髓的表達Fig. 4 Immune blotting showing expressions of p ERK in spinal cord in different groups

圖 5 各組小鼠脊髓pERK表達的免疫印跡圖像分析結(jié)果(n=24，)(a P＜0.01，各組間比較)Fig. 5 Imm une blotting show ing expressions of p ERK in sp inal cord in different groups (n=24，)(a P＜0.01, vs each other group)

討 論

胞外信號調(diào)節(jié)激酶是絲裂原活化蛋白激酶家族的主要成員之一，它能參與多種神經(jīng)可塑性變化，如長時程增強以及疼痛的產(chǎn)生與維持等[8-9]。近年來，許多痛覺方面的研究結(jié)果表明，ERK可被多種生理或病理因素激活，能夠介導(dǎo)多種胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)，在NPP發(fā)生時，其磷酸化(激活)水平增高，與傷害性刺激的傳遞及神經(jīng)敏感化有關(guān)[10-11]。利用ERK的阻斷劑可以有效抑制ERK在脊髓的活化，降低NPP動物的痛覺過敏、痛覺超敏和異位痛等現(xiàn)象，提示ERK激活在NPP的產(chǎn)生與傳導(dǎo)過程中發(fā)揮了重要的作用[12-13]。本研究結(jié)果與之前的研究結(jié)果相符，在注射辣椒素后，動物脊髓后角中的pERK表達上調(diào)，動物出現(xiàn)痛覺過敏，熱痛閾值降低，提示，ERK磷酸化水平上調(diào)是神經(jīng)病理性疼痛的一個重要發(fā)病機制，同時也是痛覺過敏的重要標志之一。

鋅離子是生命體的關(guān)鍵元素，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，這些鋅離子主要分布在神經(jīng)元的細胞質(zhì)以及細胞器的小囊泡內(nèi)，參與神經(jīng)傳遞[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓后角的神經(jīng)元中有大量的鋅離子以及其運載體—金屬硫蛋白-Ⅲ，而脊髓后角是包括痛覺等感覺在內(nèi)的初級傳入神經(jīng)元的投射部位[5-17]。Jo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)受損時，動物脊髓后角淺層的鋅離子含量顯著降低，動物出現(xiàn)了痛覺過敏現(xiàn)象，機械痛閾顯著降低，提示鋅離子與痛覺的發(fā)生與傳導(dǎo)密切相關(guān)。在本研究中，我們利用鋅預(yù)處理模型動物，注射辣椒素后，對動物行為學(xué)改變及熱痛閾值進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射辣椒素后，動物出現(xiàn)舔足、甩足等痛敏現(xiàn)象，熱痛閾值降低。高鋅預(yù)處理時，縮足等動物行為學(xué)改變明顯改善，熱痛閾值增加。而低鋅預(yù)處理使動物舔足等行為學(xué)改變加重，熱痛閾值降低。提示鋅能抑制神經(jīng)病理性疼痛的痛覺過敏。

本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高鋅預(yù)處理能降低病理性疼痛模型動物脊髓pERK的表達；而低鋅預(yù)處理的結(jié)果正好相反，增加病理性疼痛模型動物脊髓pERK的表達。提示鋅可能是通過抑制pERK在模型動物脊髓后角的表達，從而對神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生了抑制作用。

綜上所述，我們的實驗結(jié)果證實了鋅可能是通過抑制ERK在脊髓后角的活化，從而降低了中樞的興奮性和痛覺過敏，因此抑制了病理性疼痛的產(chǎn)生與傳遞。但是，鋅抑制ERK活化的確切機制目前還不十分清楚，需要我們深入地探討與研究。

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Effect of zinc on the phosphorylative ERK expression in capsaicin induced neuropathic pain in mice spinal cord and hot pain threshold

WANG Yue-jing, LIU Xiao-lu, LI Fu-xing, HAN Yan-xiu, ZHANG Li
Department of Histology and Embryology, Liaoning M edical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
Corresponding author: ZHANG Li． Email: ln_zhangli@126．com; LIU X iao-lu． Email: 347863939@qq．com

ObjectiveTo observe the effect of zinc on the expression of phosphorylative extracellularsignal-regulate kinase (pERK) in spinal cord and the hot pain threshold of capsaicin induced neuropathic pain (NPP) in model rats．MethodsSeventy two C57/ BL6 rats w ere randomly divided into 4 groups and capsaicin (0．5%, 5 μl) w as injected in feet of NPP rats to build the model．Control group: normal (zinc, 30 mg/(kg·d)) fed rats injected with solvent (Tween 80, alcohol and 0．9% sodium chloride solution); N-NPP group: normal fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks; L-NPP group: low-zinc (0．85 mg/(kg·d)) fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks; H-NPP group: high-zinc (227mg/(L·d)) fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks．Animal ethology observation, immunohistochem istry, immune blotting and image analysis w ere used to test the effect of zinc on the expression of pERK in model m ice spinal cord and the hot pain threshold during seven days after injection．ResultsHigh-zinc feed could down-regulate the pERK expression, im prove the hot pain threshold (P＜0．01), while low-zinc feed can up-regulate the pERK expression, reduce the hot pain threshold (P＜0．01)．ConclusionZinc can inhibit the pERK expression in spinal cord and the hot pain threshold of capsaicin induced NPP in model rats．

zinc; neuropathic pain; spinal cord; phosphorylation; extracellular signal-regulate kinase

R 741.02

A

2095-5227(2014)08-0863-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.024

2014-01-23

國家自然科學(xué)基金項目(81171799)；遼寧省科技廳資助項目(20111118)；遼寧醫(yī)學(xué)院奧鴻大學(xué)生創(chuàng)新基金(2011D17)；遼寧醫(yī)學(xué)院橫向課題(LYHX2013025)；遼寧醫(yī)學(xué)院奧鴻博澤研究生科研創(chuàng)新基金(2012009)；遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(201210160007) Supported by the National Natural Science Foundation of China(81171799); Science and Technology Committee Foundation of Liaoning Province(2011 1118)

王月靜，女，在讀碩士。研究方向：鋅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Email: 335187646@qq.com；共同第一作者：劉曉露，女，本科在讀。研究方向：鋅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Email: 347863939@qq.com

張莉，女，博士，教授。Email: ln_zhangli@126.com