朱曉博劉繼紅張祥生石紅林孔朝輝丁德剛

1.河南省人民醫(yī)院泌尿外科（鄭州 450003）; 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科

川芎嗪對(duì)體外精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

朱曉博1劉繼紅2張祥生1石紅林1孔朝輝1丁德剛1

1.河南省人民醫(yī)院泌尿外科（鄭州 450003）; 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科

目的研究不同濃度的川芎嗪注射液（TMP）體外對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。 方法 20例健康生育男性手淫供精，將上游優(yōu)化處理的精子，與不同濃度TMP注射液共同孵育10、30、60min，采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)觀察不同濃度TMP（0.1、1、10mmol/L）體外對(duì)精子各運(yùn)動(dòng)參數(shù)的作用。結(jié)果與對(duì)照組相比，1mmol/L濃度組，除60min時(shí)精子活率[（a+b+c）級(jí)精子%]未下降外，其余時(shí)間精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率[（a+b）級(jí)精子%]、平均直線速度（VSL）和平均路徑速度（VAP）等觀察指標(biāo)均明顯下降，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。10mmol/L濃度組，精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、VSL和VAP等觀察指標(biāo)也均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，側(cè)擺幅度（ALH）除0.1mmol/L濃度組和1mmol/L濃度組30min時(shí)未下降外，余均有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論 川芎嗪體外能顯著降低精子運(yùn)動(dòng)能力，為男性節(jié)育提供了一種新選擇。

川芎嗪; 精子能動(dòng)性; 體外研究

男性節(jié)育藥物研究已成為當(dāng)前生殖藥物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。川芎嗪是從我國(guó)傳統(tǒng)中藥川芎根莖中提取出來(lái)的一種生物堿，化學(xué)名2，3，5，6-四甲基吡嗪，簡(jiǎn)稱四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine, TMP）[1]。TMP可非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗L型電壓依賴性鈣通道，抑制細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，鈣通道拮抗劑體外對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)有顯著降低作用[3]。本研究選取20例精液參數(shù)正常男性的精液標(biāo)本，采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析（CASA）系統(tǒng)，研究不同濃度的TMP體外孵育不同時(shí)間后對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

一、精子懸液制備

按WHO標(biāo)準(zhǔn)[4]篩選本院男科門診就診的20例健康生育男性，年齡22～35歲，禁欲4～7d，手淫取精，精液液化后經(jīng)上游優(yōu)化法[4]處理，使其前向運(yùn)動(dòng)精子（a級(jí)+b級(jí)精子）百分率達(dá)50%以上，再用Ham’s F10液（Sigma公司）調(diào)節(jié)精子密度至40×106/mL。

二、川芎嗪溶液的制備

川芎嗪溶液由北京永康藥業(yè)有限公司提供，用Ham’s F10 液調(diào)整川芎嗪溶液的濃度為0.2、2及20mmol/L三種不同濃度。調(diào)pH值為7.4，置于冷藏箱中備用。所有溶液使用時(shí)均預(yù)熱至37℃。

三、實(shí)驗(yàn)方法及分組

健康生育男性的每份標(biāo)本分為4組，A組為對(duì)照組，加入100μl精子懸液和等量的Ham’s F10液，B、C、D組分別加入100μl精子懸液和等量的不同濃度川芎嗪溶液，使其終濃度分別為0.1、1、10mmol/L。將各支試管輕輕振蕩后密閉置于37℃恒溫水浴箱中孵育，分別于第10、30、60min時(shí)用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng) （杭州麥迪公司）檢測(cè)精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，每份標(biāo)本平均觀察10個(gè)視野。

四、觀察指標(biāo)

主要觀察精子的形態(tài)，并對(duì)各組精子活率[（a+b+c）級(jí)精子%]、前向性運(yùn)動(dòng)精子百分率（a級(jí)+b級(jí)精子%）、直線速度（VSL）、平均路徑運(yùn)動(dòng)速度（VAP）、側(cè)擺幅度（ALH）等指標(biāo)分別進(jìn)行分析。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)組（B、C、D組）和對(duì)照組（A組）比較用兩樣本差異顯著性檢驗(yàn)（采用t檢驗(yàn)），各實(shí)驗(yàn)組之間比較采用方差分析（Q檢驗(yàn)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

表1 孵育不同時(shí)間不同濃度TMP體外對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響（n=20,±s）

表1 孵育不同時(shí)間不同濃度TMP體外對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響（n=20,±s）

注: 與A組（對(duì)照組）比較:*P＜0.05,**P＜0.01

組別 時(shí)間(min) 活率(%) a級(jí)+b級(jí)(%) VSL(μm/s) VAP(μm/s) ALH(μm) A組 10 74.52±9.85 62.25±12.43 34.79±8.13 37.08±7.94 1.00±0.21 30 64.28±16.66 55.10±17.36 28.14±5.74 29.31±6.09 0.91±0.26 60 47.04±14.35 43.96±21.19 31.91±8.32 32.84±8.18 1.10±0.27 B組 10 68.11±10.92 58.96±13.73 24.39±11.91*23.80±6.31*0.99±0.15 30 63.12±13.15 50.56±17.08 28.20±8.41 29.59±9.03 0.96±0.15 60 51.62±12.55 43.87±16.12 24.62±10.92*25.60±10.72 1.08±0.35 C組 10 56.31±17.48*50.18±16.39*27.54±6.53*28.42±6.60*0.96±0.21 30 46.40±19.73*38.01±18.33**22.55±10.17*25.65±11.38*1.00±0.36 60 49.54±14.67 37.21±14.58*20.40±9.03*22.23±9.12*0.99±0.26 D組 10 32.22±14.67**22.07±14.24**13.09±5.40**15.23±5.96**0.93±0.33 30 21.02±8.56**15.60±9.35**10.17±5.60**14.34±6.94**0.88±0.27 60 20.87±5.61**9.26±7.29**8.67±6.48**10.97±6.84**0.82±0.33

一、TMP體外孵育不同時(shí)間對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

顯微鏡下觀察精子運(yùn)動(dòng)，可見(jiàn)隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組除30～60min時(shí)VSL、VAP和ALH未下降外，精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率，以及其余時(shí)間的VSL、VAP、ALH等觀察指標(biāo)均有下降；0.1mmol/ L濃度組除10～30min時(shí)VSL、VAP和30～60min時(shí)ALH未下降外，其余觀察指標(biāo)均有下降；1mmol/L濃度組除10～30min時(shí)ALH、30～60min時(shí)精子活率未下降外，其余觀察指標(biāo)均有下降。10mmol/L濃度組各觀察指標(biāo)均有下降。差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

二、不同濃度TMP對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

與對(duì)照組相比，0.1mmol/L濃度組，除30min時(shí)VSL、VAP及60min時(shí)精子活率未下降外，TMP體外孵育不同時(shí)間，精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、VSL、VAP等觀察指標(biāo)均有下降，其中10min時(shí)VSL、VAP及60min時(shí)VSL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），余差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。1mmol/L濃度組，除60min時(shí)精子活率未下降外，其余時(shí)間精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、VSL和VAP等觀察指標(biāo)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），10mmol/L濃度組，精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、VSL和VAP等觀察指標(biāo)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，ALH除0.1mmol/L濃度組和1mmol/L濃度組30min時(shí)未下降外，余均有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

三、不同濃度TMP體外孵育10min對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)提示孵育10min時(shí)不同濃度TMP對(duì)精子活動(dòng)率及運(yùn)動(dòng)參數(shù)影響最為明顯，因此選取10min這一時(shí)間段來(lái)分析TMP對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響。隨著濃度的增加，人精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、VSL、VAP等運(yùn)動(dòng)參數(shù)下降越明顯，與對(duì)照組相比，1mmol/ L濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；10mmol/L濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；0.1mmol/L濃度組除VSL、VAP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P＜0.05），其他參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖1～3。ALH各濃度組與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），

圖1 TMP對(duì)人精子活率和前向運(yùn)動(dòng)精子百分率的影響

圖2 TMP對(duì)人精子VSL、VAP的影響

圖3 TMP對(duì)人精子ALH的影響

討 論

TMP是從中藥川芎中分離提純出來(lái)的一種生物堿單體，可以松弛多種平滑肌[5-7]。文獻(xiàn)報(bào)道[8]，TMP具有阻滯L型電壓依賴性鈣離子通道的作用。人類精子膜上存在有電壓依賴性鈣離子通道（voltagedependent Ca2+channels, VDCCs），VDCCs在精子內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)方面起了重要作用。以往的研究[3]表明，經(jīng)典鈣通道拮抗劑硝苯地平、維拉帕米、尼莫地平、氨氯地平等均明顯抑制精子的活力。

研究TMP對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力的影響，我們選用不同濃度的TMP在體外與經(jīng)上游優(yōu)化法處理的精液參數(shù)正常的男性精子共同孵育不同時(shí)間后，通過(guò)CASA系統(tǒng)觀察TMP對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1mmol/L和10mmol/LTMP濃度組，精子活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分率、VSL、VAP等觀察指標(biāo)均有下降，且隨著TMP濃度的升高，差異性越顯著，提示TMP對(duì)精子運(yùn)動(dòng)有抑制作用。至于60min時(shí)精子活率未見(jiàn)下降，可能與我們觀察例數(shù)相對(duì)偏少有關(guān)。

在影響精子生理活動(dòng)的離子中，精子細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子可能是調(diào)控精子活動(dòng)力的關(guān)鍵。鈣離子對(duì)精子的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)精子內(nèi)鈣離子濃度的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的。存在于精子膜上的特異性鈣離子通道在精子內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié)方面起著重要的作用。VDCCs由α、β、γ3種亞單位組成，其中最重要是α1亞單位，它既是電壓感受器，又具有離子選擇性，其他亞單位起輔助調(diào)節(jié)作用[9]。根據(jù)α1的電活動(dòng)特性，可將VDCCs分為L(zhǎng)、N、P、Q、R及T等6種，目前主要研究L型和T型通道。隨著免疫熒光和分子克?。≧T-PCR）技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用，大量研究成果可以更加了解存在哺乳動(dòng)物和人類精子鞭毛區(qū)域上VDCCs的類型。Sakata等[10]利用RT-PCR和全細(xì)胞膜片鉗證實(shí)Ca(V)2.3調(diào)控小鼠精子的鞭毛運(yùn)動(dòng)。Trevino等[11]利用RT-PCR和熒光免疫共聚焦顯微鏡證實(shí)在人精子細(xì)胞中存在3種T型VDCC的α1亞單位mRNA表達(dá)，其中Ca(V)3.1和Ca(V)3.3定位在鞭毛前段和中段，用HVA抗體可以發(fā)現(xiàn)Ca(V)1.3和Ca(V)2.3的存在。因此，VDCCs在對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的發(fā)生和過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的調(diào)控作用。精子的運(yùn)動(dòng)主要依靠尾部的鞭毛。鞭毛內(nèi)因子控制鞭毛運(yùn)動(dòng)，這些因子主要是鈣離子，鈣離子負(fù)責(zé)鞭毛運(yùn)動(dòng)的對(duì)稱性。鈣離子調(diào)節(jié)鞭毛內(nèi)動(dòng)力蛋白驅(qū)動(dòng)的微管滑動(dòng)，但鈣離子信號(hào)又受鈣調(diào)蛋白（CaM）和CaM依賴性激酶（CaMK）調(diào)節(jié)，中心微管和輻是鈣離子信號(hào)通路的主要成分。鞭毛中鈣離子通過(guò)中心二微管和輻的復(fù)合體（CP/RS）改變動(dòng)力蛋白臂的滑動(dòng)，使鞭毛不停地?cái)[動(dòng)。Munire等[12]發(fā)現(xiàn)不育患者精子側(cè)擺幅度與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加呈正相關(guān)。TMP抑制精子運(yùn)動(dòng)的機(jī)制可能與其他經(jīng)典鈣通道阻滯劑一樣，通過(guò)阻滯L型電壓依賴性鈣通道，抑制胞膜外鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低所致。其具體機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

以往的研究表明，鈣離子以及鈣通道不僅能夠影響精子的運(yùn)動(dòng)，并且對(duì)精子發(fā)生、成熟、獲能及受精等過(guò)程均發(fā)揮重要作用，它是精子運(yùn)動(dòng)的調(diào)控者，獲能的參與者，頂體反應(yīng)的第二信使[13]。有理由相信，TMP可能不僅對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)有影響，其對(duì)精子的發(fā)生、成熟、獲能、受精等過(guò)程可能均發(fā)揮作用，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。TMP為男性節(jié)育藥物提供了一個(gè)新的選擇。

1 Ma L, Fan Y, Wu H,et al.Tissue distribution and targeting evaluation of TMP after oral administration of TMP-loaded microemulsion to mice.Drug Dev Ind Pharm2013; 39(12): 1951-1958

2 Pang PK, Shan JJ, Chiu KW. Tetramethylpyrazine, a calcium antagonist.Planta Med1996; 62(5): 431-435

3 李路, 劉繼紅. 鈣通道拮抗劑體外對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志 2004; 21(6): 725-727

4 谷翊群, 陳振文, 于和鳴, 等. WHO人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè). 第4版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001: 53

5 武雪, 高云芳, 趙雪紅, 等. 川芎嗪對(duì)廢用狀態(tài)下大鼠骨骼肌一氧化氮合酶活性及肌纖維內(nèi)Ca2+濃度的影響. 中華醫(yī)學(xué)雜志 2012; 92(29): 2075-2077

6 項(xiàng)薔薇, 羅運(yùn)春, 朱妍艷, 等. 川芎嗪在哮喘小鼠氣道炎癥和氣道重塑中的作用及其機(jī)制. 臨床兒科雜志2011; 29(8): 773-776

7 Wong KL, Chan P, Huang WC,et al. Effect of tetramethylpyrazine on potassium channels to lower calcium concentration in cultured aortic smooth muscle cells.Clin Exp Pharmacol Physiol2003; 30(10): 793-798

8 Pang PK, Shan JJ, Chiu KW. Tetramethylpyrazine, a calcium antagonist.Planta Med1996; 62(5): 431-435

9 Koshimizu TA, van Goor F, Tomic M,et al.Characterization of calciumsignaling by purinergic receptor channels expressed in excitable cells.Mol Pharmacol2000; 58(5): 936-945

10 Sakata Y, Saegusa H, Zong S,et al. Analysis of Ca2+currents in spermatocytes from mice lacking Ca(v)2.3 (alpha(1E)) Ca(2+) channel.Biochem Biophys Res Commun2001; 288(4): 1032-1036

11 Trevino CL, Felix R, Castellano LE,et al. Expression and differential cell distribution of low-threshold Ca2+channels in mammalian germ cells and sperm.FEBS Lett2004; 563(1-3): 87-92

12 Munire M, Shimizu Y, Sakata Y,et al. Impaired hyperactivation of human sperm in patients with infertility.J Med Dent Sci2004; 5(1): 99-104

13 Correia S, Oliveira PF, Guerreiro PM,et al. Sperm parameters and epididymis function in transgenic rats overexpressing the Ca2+-binding protein regucalcin: a hidden role for Ca2+in sperm maturation.Mol Hum Reprod2013; 19(9): 581-589

（2014-05-21收稿）

Influence of tetramethylpyrazine on human sperm motility parametersin vitro

Zhu Xiaobo1, Liu Jihong2, Zhang Xiangsheng1, Shi Honglin1, Kong Zhaohui1, Ding Degang11.Department of Urology, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, Henan , China;
2. Department of Urology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

ObjectiveTo investigate the effects of the Tetramethylpyrazine (TMP) on human sperm motility in vitro and further explore its possible mechanisms.MethodsSperm samples from 20 healthy fertile men were collected by masturbation, and then they were treated by swim-up technique to produce a spermatozoa solution of high motility. Subsequently they were incubated with different concentration of tetramethylpyrazine solution( 0.1, 1, 10mmol/L)in vitro. Sperm motility parameters at incubation time of 10, 30 and 60min were measured by computer-aided sperm analysis (CASA).ResultsContrast to the control group, In group 1mmol/L and 10 mmol/L,TMP markedly decreased the sperm live rate, progressive motility, VSL, VAP, there were signif cant difference statistically contrast to the control group. But ALH had no signif cant difference statistically contrast to the control group.ConclusionThe data suggest that tetramethylpyrazine can inhibit sperm motility in vitro, which may be a new approach for male contraception.

Tetramethylpyrazine; sperm motility;in vitro

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.009

R 979.2