蔡?hào)|華李 蕾

（1 蘇州市公安局 江蘇 蘇州 215000；2 蘇州市公安局相城分局 江蘇 蘇州 215000）

通過鮮牛奶滯留時(shí)間的相關(guān)參數(shù)判斷案發(fā)時(shí)間的研究

蔡?hào)|華1李 蕾2

（1 蘇州市公安局 江蘇 蘇州 215000；2 蘇州市公安局相城分局 江蘇 蘇州 215000）

采用紫外分光光度法，檢測(cè)牛奶中的細(xì)胞含量、糖含量、蛋白質(zhì)含量的變化，同時(shí)利用pH試紙測(cè)量酸堿變化，得到了4組數(shù)據(jù)和變化曲線。

牛奶 紫外分光光度儀 案發(fā)時(shí)間

牛奶變質(zhì)的傳統(tǒng)檢測(cè)一般是用生物、化學(xué)的原理來(lái)建立一些指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)平皿菌落計(jì)數(shù)法、大腸桿菌群乳糖膽鹽發(fā)酵法等。這些方法技術(shù)成熟，容易做出量化的指標(biāo)，但存在操作煩瑣、費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)牛奶都開始大范圍的使用物理儀器，優(yōu)點(diǎn)是快速、精確。但目前的研究都僅限于單方面的參數(shù)，如R.Tsenkova等人通過近紅外光譜來(lái)檢測(cè)牛奶中的體細(xì)胞數(shù)；朱亞菲等人利用旋光法測(cè)定牛奶中糖的含量。本文在總結(jié)前人對(duì)牛奶中各種物質(zhì)檢測(cè)和分析所用方法的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)：利用紫外分光光度儀可以同時(shí)對(duì)牛奶中的細(xì)胞含量、糖含量、蛋白質(zhì)含量的變化進(jìn)行跟蹤測(cè)量。此方法快速、準(zhǔn)確、成本較低，極其適合公安工作。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品

用蒙牛特侖蘇盒裝純牛奶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取牛奶全部為同一批次。選擇日期為實(shí)驗(yàn)前1天生產(chǎn)的新鮮牛奶。實(shí)驗(yàn)前1天，準(zhǔn)備22個(gè)燒杯，7天實(shí)驗(yàn)，每天3個(gè)樣本，共21個(gè)燒杯都倒上40mL的牛奶，編號(hào)為1.1，1.2，1.3，……7.1，7.2，7.3。第22個(gè)燒杯為空白樣本，倒?jié)M，編號(hào)為0。為保證實(shí)驗(yàn)條件的一致，將1-21號(hào)燒杯至于恒溫恒濕箱內(nèi)，模仿夏日條件，設(shè)溫度為30℃，濕度為80℃。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)的UV-2600型紫外可見分光光度儀；上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)的LRHS-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱；上海康華生化儀器制造有限公司 HS-6001超級(jí)恒溫水浴箱；德國(guó)eppendorf公司產(chǎn)的5804R離心機(jī)。

試劑：磷酸、無(wú)菌水、100ug/mL的酪氨酸溶液、0.9%的NaCl溶液、DNS試劑、1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、酒精。

1.3 方法

1.3.1 波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量時(shí)選用的吸收波長(zhǎng)關(guān)乎著實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確，因此，必須先用樣品牛奶進(jìn)行吸收波長(zhǎng)的預(yù)實(shí)驗(yàn)，即當(dāng)牛奶中需要測(cè)量的物質(zhì)出現(xiàn)最強(qiáng)吸收峰時(shí)，峰值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)便為最佳波長(zhǎng)。細(xì)胞、糖、蛋白質(zhì)的最佳波長(zhǎng)分別為600nm，540nm，280nm。

1.3.2 測(cè)定牛奶中的細(xì)胞含量

設(shè)定波長(zhǎng)為600nm，第1天在樣本0和樣本1.1，1.2，1.3（第2天重復(fù)第1天操作，在出現(xiàn)固體的時(shí)候取上清液）中分別取2mL牛奶注入比色皿中。用空白樣調(diào)零，再依次放入1.1，1.2，1.3號(hào)樣本，測(cè)量，記錄OD值，并通過公式1/108=OD/X（X為細(xì)胞含量）來(lái)計(jì)算該樣本中的細(xì)胞含量。3份樣本分別測(cè)完后取平均值，并繪制變化曲線。

1.3.3 測(cè)定牛奶中的糖含量

第一步制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取離心管，按表1配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制

將各離心管搖勻，在沸水浴中加熱5min后冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至2.5mL。設(shè)紫波長(zhǎng)為540nm，用0號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)出1-6號(hào)管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，得出線性回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

第二步牛奶樣品中還原糖的提取。樣品組按磷酸0.25mL，無(wú)菌水 1.05mL，待測(cè)樣品 （牛奶）0.2mL，37℃水浴30min，DNS2.5mL，沸水浴10min，流水冷卻3min，離心1000rpm，4℃，10min，取上清液2mL測(cè)定OD值（540nm）的順序添加和操作?？瞻捉M按磷酸0.25mL，無(wú)菌水1.05mL，空白樣品（蒸餾水）0.2mL，加2.5mLDNS，37℃水浴30min，沸水浴 10min，流水冷卻 3min，離心 1000rpm，4℃，10min，取上清液2mL測(cè)定OD值（540nm）的順序添加和操作。

第三步測(cè)量。用空白組調(diào)零后，在540nm的波長(zhǎng)下測(cè)定1.1，1.2，1.3號(hào)樣本的OD值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用公式：

便可求出牛奶中的總糖含量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，總糖含量的變化為縱坐標(biāo)繪制牛奶中糖含量的變化曲線。

1.3.4 測(cè)定牛奶中的蛋白質(zhì)含量

第一步用酪蛋白配置蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。取試管，按表2配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。

表2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液配制

將各試管搖勻。設(shè)波長(zhǎng)為280nm，用0號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)出1-5號(hào)管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，得出線性回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

第二步，配取待測(cè)液。將每份牛奶稀釋10倍，取稀釋后的待檢液2mL，用0.9%的NaCl溶液定容至10mL，在280nm的波長(zhǎng)下測(cè)定1.1，1.2，1.3號(hào)樣本的OD值。取平均值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并利用公式：

來(lái)計(jì)算牛奶中的實(shí)際蛋白質(zhì)濃度，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，牛奶中實(shí)際蛋白質(zhì)濃度為縱坐標(biāo)繪制蛋白含量的變化曲線。

1.3.5 測(cè)定牛奶的酸堿變化

利用pH試紙，試紙保持干燥，放入溶液半分鐘后取出與標(biāo)準(zhǔn)樣板比較。得出溶液的pH值，記錄并繪制變化曲線。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖4-圖7（單位：×107個(gè)/mL）。

圖3 牛奶中細(xì)胞含量隨時(shí)間變化曲線圖

圖4 牛奶中糖含量隨時(shí)間變化曲線圖

圖5 牛奶中蛋白含量隨時(shí)間變化曲線圖

圖6 牛奶pH值隨時(shí)間變化的曲線圖

從圖中可以看出4項(xiàng)參數(shù)的變化趨勢(shì)。牛奶中的細(xì)胞含量會(huì)隨著時(shí)間的推移先上升，經(jīng)歷過一段平穩(wěn)期后再逐漸下降。牛奶中的糖含量和蛋白質(zhì)含量都會(huì)隨著時(shí)間逐漸下降。牛奶的pH值會(huì)隨著時(shí)間的推移越來(lái)越小，即牛奶會(huì)越來(lái)越酸，但下降到一定程度趨于平穩(wěn)后，就不再下降。

3 討論

細(xì)胞含量出現(xiàn)以上變化是因?yàn)榕Ｄ讨懈缓⑸锓敝乘璧臓I(yíng)養(yǎng)，微生物很容易繁殖。鮮牛奶中一旦有細(xì)菌開始滋生繁殖，其中的各種養(yǎng)分在這些微生物的作用下就會(huì)發(fā)生一系列變化。而細(xì)菌本身的繁殖變化就具有一定的規(guī)律，分為4個(gè)階段，第1階段為遲緩期。即細(xì)菌的適應(yīng)期，所以繁殖較少。第2階段為對(duì)數(shù)期。此期活菌數(shù)直線上升，可因不同的條件持續(xù)幾小時(shí)至幾天不等。第3階段為穩(wěn)定期。該期的生長(zhǎng)菌群總數(shù)處于平坦階段。但由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性產(chǎn)物積累，pH下降等不利因素，細(xì)菌繁殖速度漸趨下降。第4階段為衰亡期。隨著穩(wěn)定期的發(fā)展，細(xì)菌繁殖越來(lái)越慢直至逐漸死亡?？梢娕Ｄ讨屑?xì)胞的變化規(guī)律與此基本相符。

糖含量出現(xiàn)以上變化是因?yàn)榕Ｄ讨械慕^大部分細(xì)菌都含有能分解乳糖的酶。例如：乳糖桿菌中含有乳糖酶，可將乳糖分解為D-(+)-葡萄糖和D-(+)-半乳糖；這些單糖隨即又被其他的酶轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?6-磷酸酯，后者又依次被其他8種酶、經(jīng)過10個(gè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為丙酮酸。所以隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，牛奶中的糖含量會(huì)越來(lái)越少。

蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)以上變化是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的微生物降解反應(yīng)。蛋白質(zhì)被牛奶中細(xì)菌的酶分解為各種氨基酸的混合物，這些氨基酸又進(jìn)一步被分解為各種有機(jī)酸、醛、醇和其他無(wú)機(jī)小分子物質(zhì)。反應(yīng)的主要機(jī)理是各種氨基酸先被氧化脫氨再脫羧。所以隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，牛奶中的蛋白含量會(huì)越來(lái)越少。

pH值的變化主要是因?yàn)槿樗岬漠a(chǎn)生。隨著乳酸的生成，牛奶的pH不斷下降，雖然細(xì)菌的繁殖使牛奶的pH降低且出現(xiàn)凝結(jié)現(xiàn)象，但牛奶中的細(xì)菌并不喜歡酸性環(huán)境。低pH的酸性環(huán)境抑制了細(xì)菌的繁殖，因此下降到一定程度時(shí)就不會(huì)再下降，也不會(huì)再產(chǎn)生乳酸了。

本方法優(yōu)點(diǎn)，利用檢測(cè)儀器，能檢測(cè)到不同溫度，不同濕度，不同品牌的牛奶中這4組數(shù)據(jù)的變化，并以此可以建立一個(gè)完備的數(shù)據(jù)庫(kù)。一旦現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)開封牛奶，經(jīng)過對(duì)其中4組參數(shù)的測(cè)量，再與數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，就能作為一個(gè)很好的輔助手段幫助我們反推牛奶的開封時(shí)間，進(jìn)而在缺少能準(zhǔn)確判斷案發(fā)時(shí)間條件的情況下，幫助我們判斷案發(fā)時(shí)間。該方法簡(jiǎn)便、客觀、微量、準(zhǔn)確。

但是，該種方法也具有一定的局限，首先，4組數(shù)據(jù)需要一起運(yùn)用，單獨(dú)一組可能會(huì)出現(xiàn)誤差。其次，判斷的時(shí)間有限，時(shí)間過長(zhǎng)后牛奶中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，牛奶中的這4項(xiàng)指標(biāo)都會(huì)失去參考價(jià)值；再次，細(xì)菌種群對(duì)牛奶的影響；最后，要建立成一個(gè)完備的數(shù)據(jù)庫(kù)還需要大量的實(shí)驗(yàn)。

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（責(zé)任編輯：于 萍）

D918.92

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2013-12-1

蔡?hào)|華（1989-），男，江蘇鹽城人，蘇州市公安局民警，學(xué)士。