文 一，郜志云，白 輝，朱崗輝

環(huán)境保護(hù)部環(huán)境規(guī)劃院，北京100012

地下水是可利用水資源的重要組成部分，全球三分之一的淡水資源來(lái)自于地下水，也是許多國(guó)家的主要飲水來(lái)源［1］。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，地下水環(huán)境面臨越來(lái)越多的威脅，病原微生物成為影響地下水環(huán)境的重要污染物［2］。以地下水為媒介傳播疾病的微生物主要包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)，能引發(fā)霍亂、傷寒、傳染性肝炎、鉤端螺旋體等疾病，會(huì)造成大規(guī)模傳染病的暴發(fā)［3］。在發(fā)展中國(guó)家，約80%的疾病是由水生病原菌引起的，這些疾病造成每天約27 000人死亡［4］;在美國(guó)，每年估計(jì)有590萬(wàn)人因暴露地下水病原菌而致病，造成9 400 人死亡［5］。

隨著人口增長(zhǎng)和土地利用擴(kuò)展，病原菌污染源增加，增加了地下水污染的可能性，因此開(kāi)展地下水中病原菌監(jiān)測(cè)是保障飲水安全，保護(hù)人群健康的重要前提。目前中國(guó)地下水中病原菌的檢測(cè)方法主要為傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法［6］，該方法存在操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、部分病原菌難以檢測(cè)等問(wèn)題，難以滿足當(dāng)前地下水環(huán)境管理對(duì)檢測(cè)技術(shù)的需求。核酸擴(kuò)增、生物芯片及生物傳感器等檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前重要的水體病原菌檢測(cè)手段。發(fā)展快速、精確的病原菌檢測(cè)技術(shù)是世界各國(guó)研發(fā)的熱點(diǎn)，該文對(duì)近年來(lái)國(guó)際上出現(xiàn)的地下水病原菌檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)要的介紹，以期為地下水中病原菌的有效監(jiān)測(cè)和控制提供技術(shù)支持。

1 地下水中的病原菌

地下水中的病原菌微生物一般來(lái)自人與動(dòng)物的排泄物，特別是糞便，其污染源有發(fā)生滲/泄漏的垃圾填埋場(chǎng)、畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、污水處理廠和接納生活和畜禽污水的地表水體［7］，通過(guò)土壤淋濾和地表水-地下水水力交換進(jìn)入到地下水中。

地下水常見(jiàn)的污染致病菌主要為腸道菌如大腸桿菌(Escherichia Coli)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter)及水生細(xì)菌如嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)等多種細(xì)菌，詳見(jiàn)表 1［8-13］。

大多數(shù)通過(guò)人或動(dòng)物的糞便進(jìn)入水體的水源性病原菌不能在水中生長(zhǎng)，但某些病原菌，如軍團(tuán)菌、非典型分支桿菌、類(lèi)鼻疽伯克氏菌是環(huán)境微生物，可在水體或土壤中生長(zhǎng)，增加人群暴露風(fēng)險(xiǎn)。除攝入途徑外，有些病原菌還可通過(guò)吸入和皮膚接觸暴露于人群，如軍團(tuán)菌和非典型分支桿菌可通過(guò)吸入途徑引起呼吸道感染，類(lèi)鼻疽伯克氏菌則可通過(guò)接觸傳播引起接觸部位的感染。大部分病原菌可引起腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、頭痛等輕微癥狀，少部分強(qiáng)致病菌在較低感染濃度下可引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病甚至死亡。

表1 地下水中常見(jiàn)病原菌

2 病原菌遷移轉(zhuǎn)化

病原菌在地下水中的遷移轉(zhuǎn)化受到表層土壤和包氣帶厚度、地質(zhì)構(gòu)造、水文地質(zhì)狀況和污染源類(lèi)型的影響，見(jiàn)表2［14］。土壤和包氣帶通過(guò)過(guò)濾和吸附作用阻止病原菌向地下水中遷移。土壤粒徑分布是影響過(guò)濾效果的重要因素，粒徑越小，效果越好，因?yàn)榧?xì)顆粒物的死端孔隙能有效過(guò)濾病原菌;吸附作用受到包氣帶疏水性、土壤和沉積物濕度、pH、離子強(qiáng)度的影響。相比于含水層，表層土壤和包氣帶具有更強(qiáng)的使病原菌衰減的能力，Schijven研究結(jié)果表明，在沙丘中傳染性病毒用25 d從污染源遷移了30 m，病毒數(shù)量減少了8個(gè)數(shù)量級(jí)，在該場(chǎng)地的含水層中，要降低到相同的數(shù)量需要遷移 40 d［15］。

表2 地下水中影響病原菌遷移的因素

病原菌進(jìn)入含水層后，含水層孔隙度和水流速度是影響病原菌衰減和遷移的重要因素?？紫丁r溶和裂隙地下水具有不同的流速，對(duì)病原菌的衰減程度各不相同［16］，在孔隙地下水中，地下水流速為每天十幾米，病原菌不容易遷移，易發(fā)生衰減;在巖溶水中，由于較大的水流速度，病原菌可以每天遷移數(shù)公里，因此裸露的巖溶含水層易受病原菌的污染。大量結(jié)果表明，水源性疾病容易在非孔隙型地下水中爆發(fā)，特別是在基巖裂隙或者巖溶地下水中發(fā)生［17］。因此，應(yīng)重視巖溶和裂隙地下水等環(huán)境敏感地區(qū)的地下水病原菌污染的監(jiān)測(cè)工作。

3 地下水中病原菌檢測(cè)現(xiàn)狀

目前大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)仍采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)環(huán)境中病原菌進(jìn)行檢測(cè)。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得檢測(cè)結(jié)果的成本和時(shí)限問(wèn)題，對(duì)于地下水中特殊病原菌的檢測(cè)，目前一般僅限于確認(rèn)是否污染或確證某種水處理工藝的有效性，而對(duì)于微生物的監(jiān)測(cè)通常僅限于指示性微生物，如用總大腸菌群監(jiān)測(cè)水處理效果，用埃希氏大腸桿菌指示水體是否被糞便污染。然而多數(shù)病原菌的存在條件與指示微生物的存在條件不是完全相關(guān)的，用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法很難直接反映其污染情況，因此僅檢測(cè)一種或少數(shù)幾種病原菌的濃度并不能反映病原菌的污染情況，如流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明總大腸菌數(shù)，糞大腸菌數(shù)等指示微生物與霍亂弧菌、志賀氏菌等引起的病理學(xué)發(fā)病率的相關(guān)性較差，這些情況都說(shuō)明傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已經(jīng)過(guò)時(shí)，很難起到監(jiān)測(cè)水體環(huán)境質(zhì)量的作用［18］。

4 影響地下水中病原菌檢測(cè)的因素

對(duì)地下水中病原菌檢測(cè)影響因素的了解，是研發(fā)有針對(duì)性檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)。影響地下水中病原菌的檢測(cè)因素主要包括以下3個(gè)方面：1)水體體積較大，水體中微生物濃度相對(duì)較低，很難直接從大量水中分離或檢測(cè)到少量的特定病原菌［19］;2)水體中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏，病原菌污染水體并經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的適應(yīng)后易形成存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)［20］;3)隨著人類(lèi)活動(dòng)的增加，病原菌污染水體的機(jī)會(huì)也相應(yīng)增加，這也相應(yīng)提高了對(duì)水體中病原菌監(jiān)測(cè)的種類(lèi)、場(chǎng)所及頻次等要求。因此，快速、高通量、準(zhǔn)確特異性是水體病原菌檢測(cè)技術(shù)研究中需考慮的重要因素。

5 不同病原菌檢測(cè)方法在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

病原菌檢測(cè)技術(shù)主要分為以下幾大類(lèi)：傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、生物芯片法(biochip)、生物傳感器(biosensor)等方法，如表3所示。平板培養(yǎng)法檢測(cè)所需周期長(zhǎng)，很多病原菌檢測(cè)方法還未建立，更重要的是許多微生物不能在固體培養(yǎng)基上形成菌落，環(huán)境中物理或化學(xué)等因素也易影響病原菌的活性而形成不可培養(yǎng)狀態(tài)，影響對(duì)水體病原微生物及時(shí)和有效的監(jiān)測(cè)［21-22］。免疫學(xué)方法檢測(cè)病原菌的假陽(yáng)性或假陰性率較高，不能反映水體中病原菌實(shí)際污染情況。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、生物芯片法、生物傳感器等生物和生物物理方法，因?yàn)槠淇焖凫`敏、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)被廣泛關(guān)注。下面對(duì)上述3類(lèi)新技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)介紹。

表3 地下水中病原菌主要檢測(cè)技術(shù)

5.1 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)技術(shù)在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)特異寡核苷酸引物，并在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶和4種dNTP，以目的基因?yàn)槟０暹M(jìn)行多個(gè)循環(huán)的DNA體外擴(kuò)增的技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)可通過(guò)擴(kuò)增獲得大量目的基因。PCR及其衍生的方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，已用于檢測(cè)或鑒別不同類(lèi)型水體中的一種或多種病原菌［23-24］，但單獨(dú)使用上述方法不能區(qū)分活菌和死菌，易造成假陽(yáng)性，研究發(fā)現(xiàn)在熒光定量PCR或基因芯片等核酸擴(kuò)增技術(shù)中利用疊氮溴化丙錠(propidium monoazide)，可選擇性結(jié)合修飾死菌細(xì)胞的DNA，從而間接計(jì)算出水體樣本中活菌數(shù)量，提高PCR技術(shù)的檢測(cè)準(zhǔn)確度［25-26］。另外由于病原菌在水體中的濃度較低，可通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的前增菌或濃縮處理，增加目標(biāo)活菌的濃度，稀釋干擾雜質(zhì)，復(fù)蘇受損細(xì)菌［27-29］，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。為了避免長(zhǎng)時(shí)間的增菌或濃縮步驟，He等［30］采用免疫磁珠(IMS)直接從水樣中特異性捕獲產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)。微生物的rRNA(pre-rRNA)是一種反映系統(tǒng)發(fā)育特性和指示生理狀態(tài)的總rRNA的重要成分，Cangelosi等［31］通過(guò)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)分析pre-rRNA的變化情況達(dá)到檢測(cè)活病原菌的目的。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Lamp)是一種比PCR技術(shù)更靈敏，速度更快的核酸擴(kuò)增技術(shù)，依賴于能夠識(shí)別靶DNA上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，1 h即可完成。Yamazaki等［32］用 Lamp檢測(cè)產(chǎn)霍亂毒素的霍亂弧菌，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，靈敏度提高10倍。為了改善Lamp的應(yīng)用性，Chang等［33］將病原菌DNA磁珠提取組件及微流控LAMP反應(yīng)芯片和光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)整合成一臺(tái)可快速、靈敏、方便的裝置，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中水體中病原菌的檢測(cè)。

5.2 生物芯片技術(shù)在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

生物芯片技術(shù)是采用原位合成或微矩陣點(diǎn)樣等方法將大量的生物分子有序地固定在硅膠片等固化材料上，然后與已標(biāo)記的待測(cè)樣品進(jìn)行作用，通過(guò)特定的儀器分析相應(yīng)的作用情況而達(dá)到分析檢測(cè)的目的。根據(jù)生物芯片所選用固化材料的不同，可將生物芯片分為基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片及組織芯片等，各種生物芯片檢測(cè)技術(shù)均具有檢測(cè)通量和自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，目前對(duì)水中病原菌檢測(cè)應(yīng)用較多的主要是基因芯片和微流控芯片。Zhou［34］等針對(duì)細(xì)菌的16S-23S rRNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和促旋酶B基因序列設(shè)計(jì)寡核苷酸基因芯片，可同時(shí)檢測(cè)水體中包括肺炎軍團(tuán)菌、沙門(mén)氏菌、致賀氏菌、腸炎耶爾森菌及霍亂弧菌等28種致病菌，重復(fù)性和特異性較好，在飲用水中添加陽(yáng)性細(xì)菌后檢測(cè)靈敏度最低可至0.1 ng DNA或104CFU/mL。微流控芯片(Microfluidic lab-on-a-chip)具有比表面積大、樣品需要量小及檢測(cè)通量高等多種優(yōu)點(diǎn)，Agrawal等［35］將其同免疫磁納米粒子及碲化鎘量子點(diǎn)標(biāo)記結(jié)合可快速靈敏地同時(shí)檢測(cè)水中低濃度的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌。Cichova等［36］在研究水中病原菌的檢測(cè)過(guò)程中，應(yīng)用微電化學(xué)技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種微流控生物芯片，可在線裂解病原菌并提取核酸，從而有利于后續(xù)的快速檢測(cè)。Dharmasiri等［37］用O157多克隆抗體共價(jià)耦聯(lián)修飾微流控芯片后，可快速富集水體中較低濃度(＜100細(xì)胞/毫升)的E．coli O157：H7，然后將富集的菌體使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR針對(duì)slt1基因擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果表明，該方法的回收率可達(dá)到72%，檢出限最低達(dá)到6 CFU/L。Liu等［38］用低蛋白結(jié)合膜獲得菌體，然后直接提取RNA并進(jìn)行RT-PCR后，利用芯片檢測(cè)E．coli O157：H7的rfbE和fliC基因，該方法最低可檢測(cè)到自來(lái)水中的3～4 CFU/L的E．coli O157：H7，河水中最低可檢測(cè)7 CFU/L的E．coli O157：H7。

5.3 生物傳感器檢測(cè)技術(shù)在地下水中的應(yīng)用現(xiàn)狀

生物傳感器起源于20世紀(jì)60年代，是將生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件緊密結(jié)合，從而檢測(cè)目標(biāo)物的分析裝置。不同的生物識(shí)別元件和信號(hào)轉(zhuǎn)換元件組成了不同的生物傳感器，分類(lèi)方式有多種，可根據(jù)生物識(shí)別元件或信號(hào)轉(zhuǎn)換元件分。轉(zhuǎn)化元件，目前的生物傳感器主要包括電化學(xué)生物傳感器、電流生物傳感器、電位生物傳感器、阻抗生物傳感器、光學(xué)生物傳感器和壓電生物傳感器等，目前在致病菌檢測(cè)方面研究較多的是電化學(xué)生物傳感器、光學(xué)生物傳感器和壓電生物傳感器［39］。Simpson 等［40］直接利用光纖可視生物傳感器在2 h內(nèi)快速檢測(cè)水體中的大腸桿菌，不但降低了基質(zhì)中的PCR反應(yīng)抑制劑，還減少了對(duì)樣品進(jìn)行前增菌處理過(guò)程，提高了檢測(cè)速度。Chowdhury等［41］用基于共價(jià)連接在電極上多聚苯胺膜的抗原抗體反應(yīng)制成的阻抗生物傳感器檢測(cè)水中的E．coliO157：H7。目前，用于水中致病菌檢測(cè)的生物傳感器種類(lèi)很多，也有不少商品化的儀器問(wèn)世，但其檢測(cè)限還偏高，在實(shí)際檢測(cè)中易出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性的結(jié)果。未來(lái)生物傳感器的發(fā)展趨勢(shì)和重點(diǎn)方向是微型化、多功能化、智能化和集成化，開(kāi)發(fā)新一代低成本、高靈敏度、高穩(wěn)定性和高壽命的生物傳感器是目前研究的熱點(diǎn)。

6 討論

目前，中國(guó)對(duì)于水體中病原菌等微生物的檢測(cè)種類(lèi)相對(duì)于水體中日益增多的病原菌污染仍然比較少，主要限于菌落總數(shù)、大腸菌群和軍團(tuán)菌等。另外，檢測(cè)手段也比較落后，主要包括微生物的分離純化，生化鑒定、血清學(xué)鑒定、酶學(xué)鑒定等常規(guī)方法或普通PCR鑒定。隨著分子生物學(xué)、物理、電子、材料等多種學(xué)科的發(fā)展，病原菌的檢測(cè)手段也日益豐富，熒光定量PCR、生物芯片或生物傳感器等技術(shù)手段得到廣泛的研究和發(fā)展，水體中病原菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性、檢測(cè)速度、特異性和靈敏度都得到了極大的改善和提高。對(duì)于水中病原菌的檢測(cè)，除了以上幾種主要技術(shù)外還有幾種技術(shù)值得研究。如Fan等［42］應(yīng)用表面增強(qiáng)拉曼光譜結(jié)合納米技術(shù)檢測(cè)水中的多種致病菌，研究表明該技術(shù)有望進(jìn)行快速靈敏的檢測(cè)。Hunter等［43］應(yīng)用死端超濾濃縮水中E．coli O157：H7后，可有效進(jìn)行IMS/ATP(免疫磁珠捕獲－ATP)的活菌檢測(cè)。Keserue等［44］利用流式細(xì)胞儀結(jié)合膜濃縮技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)研究對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的快速檢測(cè)，靈敏度高，而且可識(shí)別細(xì)菌的不同狀態(tài)。然而上述這些技術(shù)手段在中國(guó)還沒(méi)得到有效應(yīng)用，主要原因是這些檢測(cè)技術(shù)的研究主要集中在對(duì)分離純化好的病原菌的檢測(cè)階段，病原菌的前增菌和分離純化仍然是這些檢測(cè)技術(shù)難以突破的技術(shù)瓶頸，另外，這些技術(shù)的成本昂貴也是難以在實(shí)際監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用的因素。

7 展望

各種致病菌檢測(cè)技術(shù)各有所長(zhǎng)，也有各自的缺陷。綜上所述，目前病原菌檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是將PCR、生物芯片等檢測(cè)技術(shù)同微流控分離、免疫磁珠分離、納米材料標(biāo)記等結(jié)合，利用不同技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、便攜甚至在線監(jiān)測(cè)的目的。因此，未來(lái)對(duì)地下水中病原菌的檢測(cè)技術(shù)還要更多考慮多種技術(shù)平臺(tái)或手段的整合，同時(shí)兼顧成本和實(shí)用性，以期為保障人類(lèi)健康和飲用水安全提供更強(qiáng)有力的支撐。

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