任 鵬 鄭吉龍 單 迪

（中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

應(yīng)用免疫熒光技術(shù)推斷皮膚燙傷時(shí)間

任 鵬 鄭吉龍 單 迪

（中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035）

制作小鼠皮膚燙傷模型，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分別對(duì)小鼠皮膚燙傷后不同時(shí)間標(biāo)記MPO、F4/80及α-SMA，以此統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)綜合此3種細(xì)胞表達(dá)時(shí)序性變化可更加準(zhǔn)確推斷皮膚燙傷時(shí)間，與HE染色結(jié)果比較，免疫熒光技術(shù)更加敏感可靠。

免疫熒光染色 皮膚燙傷 MPO F4/80 α-SMA

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚燙傷模型制作與分組

健康成年昆明系SPF級(jí)小鼠35只，雌雄不限，體質(zhì)量25g～35g，隨機(jī)分為7組，其中1個(gè)對(duì)照組，6個(gè)燙傷組，每組5只。小鼠背部皮膚備皮，戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔麻醉后，將小鼠四肢伸展俯臥狀固定。室溫下（20℃～24℃），使沸水與燙傷組小鼠皮膚持續(xù)接觸10s，接觸面積（燙傷面積）為直徑1cm圓形。燙傷后小鼠不給予任何處理實(shí)驗(yàn)條件下，分籠飼養(yǎng)并分別于傷后1d、3d、5d、7d、10d及14d乙醚麻醉處死，以背部燙傷區(qū)為中心取材2cm×2cm皮膚，用4%多聚甲醛中性液固定后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制作5μm石蠟切片。

1.2 免疫熒光染色

常規(guī)脫蠟、脫苯、水化；5%BSA封閉1h；滴加用抗體稀釋液稀釋的兔抗小鼠MPO（1∶200）、大鼠抗小鼠F4/80（1∶200）、兔抗小鼠α-SMA（1∶200）IgG多克隆抗體，保濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488-山羊抗大鼠IgG二抗，室溫下保濕盒內(nèi)避光孵育2h；滴加Hoechst33258，室溫下避光保濕盒內(nèi)3min；滴加抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察；染色過(guò)程中以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，常規(guī)做HE染色。

1.3 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析

普通光學(xué)顯微鏡×400下，燙傷區(qū)及燙傷周邊區(qū)每張切片中隨機(jī)選擇10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算這兩種細(xì)胞占視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比。熒光顯微鏡×400下，燙傷區(qū)及燙傷周邊區(qū)每張切片中隨機(jī)選擇10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)MPO+細(xì)胞、F4/80+細(xì)胞及α-SMA+細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算這三種細(xì)胞占視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比。采用SPSS13.0 for Windows軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 燙傷宏觀所見(jiàn)

小鼠皮膚燙傷后局部皮膚呈淡紅色，無(wú)紅斑及水泡，切開(kāi)內(nèi)面觀可見(jiàn)水腫、充血，背部肌肉未見(jiàn)損傷。傷后1d，燙傷區(qū)界限清晰，表面干燥；傷后3d，創(chuàng)緣皮膚收縮，界限清晰；傷后5d～7d，痂皮形成，表面淡棕黃色，燙傷區(qū)域縮小；傷后10d，燙傷區(qū)痂皮開(kāi)始脫落，燙傷區(qū)明顯縮?。粋?4d燙傷區(qū)痂皮大部分脫落，燙傷區(qū)進(jìn)一步縮小。

2.2 HE染色

經(jīng)常規(guī)HE染色，傷后1d，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主；傷后3d，損傷周邊上皮角形成明顯，巨噬細(xì)胞增多；傷后5d，可見(jiàn)梭形成纖維細(xì)胞和大量巨噬細(xì)胞，可見(jiàn)較明顯肉芽組織；傷后7d，肉芽組織內(nèi)可見(jiàn)梭形成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管；傷后10d～14d，見(jiàn)大量梭形成纖維細(xì)胞，間質(zhì)增多，毛囊增多。HE染色后中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)分析參見(jiàn)表1。

表1 燙傷后各時(shí)間段的HE染色中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞百分率

2.3 燙傷區(qū)及周邊區(qū)MPO+細(xì)胞、F4/80+細(xì)胞、α-SMA+細(xì)胞表達(dá)

MPO+主要在多型核粒細(xì)胞中表達(dá)，皮膚燙傷1d～7d，MPO+細(xì)胞表達(dá)逐漸減低，傷后10d～14d，MPO+細(xì)胞消失，1d MPO+細(xì)胞表達(dá)高峰。F4/80+主要在單個(gè)核細(xì)胞中表達(dá)，皮膚燙傷1d～5d，F(xiàn)4/80+細(xì)胞逐漸增高，傷后7d～14d，F(xiàn)4/80+細(xì)胞表達(dá)逐漸減低，5d F4/80+細(xì)胞表達(dá)高峰。α-SMA+主要在單個(gè)核長(zhǎng)梭形細(xì)胞中表達(dá)，傷后1d，未見(jiàn)α-SMA+細(xì)胞，3d～14d α-SMA+細(xì)胞表達(dá)逐漸增高，14d α-SMA+細(xì)胞表達(dá)高峰。小鼠皮膚燙傷后各時(shí)間段的MPO+細(xì)胞、F4/80+細(xì)胞、α-SMA+細(xì)胞百分率見(jiàn)圖，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見(jiàn)表2。

圖 燙傷后各時(shí)間段的MPO+細(xì)胞、F4/80+細(xì)胞、α-SMA+細(xì)胞百分率

表2 燙傷后各時(shí)間段的熒光染色MPO+細(xì)胞、F4/80+細(xì)胞、α-SMA+細(xì)胞百分率

2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1為HE染色下中性粒細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)百分率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各相鄰兩組之間中性粒細(xì)胞細(xì)胞和巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)百分率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。表2為免疫熒光技術(shù)染色下MPO+細(xì)胞、F4/80+細(xì)胞、α-SMA+細(xì)胞百分率，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各相鄰兩組之間MPO+細(xì)胞、F4/80+細(xì)胞、α-SMA+細(xì)胞百分率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

3 討論

皮膚燙傷是法醫(yī)學(xué)中經(jīng)常遇到的損傷，燙傷時(shí)間推斷也是法醫(yī)學(xué)工作難點(diǎn)。皮膚燙傷愈合是一個(gè)連續(xù)而又復(fù)雜的生理過(guò)程，和通常皮膚損傷一樣大致可分為三個(gè)階段：急性滲出期、纖維增生期和組織重建期。在急性滲出期，各種類型的炎癥細(xì)胞，例如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，浸潤(rùn)到損傷區(qū)域參與清除損傷壞死組織、異物及入侵的病原體等。在纖維增生期，肌成纖維細(xì)胞主要參與損傷組織的修復(fù)。本文制作小鼠皮膚深Ⅱ°燙傷模型，觀察發(fā)現(xiàn)早期小鼠皮膚全層燙傷，組織疏松，內(nèi)面紅腫。鏡下?lián)p傷早期可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以中性粒細(xì)胞為主，并可見(jiàn)少量巨噬細(xì)胞。隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，可見(jiàn)中性粒細(xì)胞逐漸減少，巨噬細(xì)胞逐漸增多，并開(kāi)始出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞并且數(shù)量逐漸增加；隨著皮膚愈合過(guò)程的進(jìn)一步延長(zhǎng)，肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞開(kāi)始逐漸減少，膠原纖維開(kāi)始形成，肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)變。

本研究采用免疫熒光技術(shù)對(duì)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記，把這3種細(xì)胞在皮膚燙傷愈合過(guò)程中時(shí)序性表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)分析。免疫熒光技術(shù)基本原理是抗原抗體反應(yīng)，對(duì)某種特定細(xì)胞抗原給予相匹配的抗體，由于抗原抗體之間存在高度特異性，當(dāng)抗原出現(xiàn)數(shù)量或位置變化時(shí)，抗體也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化，將熒光素標(biāo)記在抗體上，在熒光顯微鏡下觀察就會(huì)出現(xiàn)特異性的熒光。免疫熒光技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于敏感度高，比較免疫組織化學(xué)技術(shù)來(lái)看，雖同為抗原抗體反應(yīng)，但其熒光的敏感度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于免疫組化的生物素標(biāo)記。特異性好，利用抗原抗體反應(yīng)高度特異性，在觀察某種特定細(xì)胞時(shí)，只要標(biāo)記該細(xì)胞的特異性抗原就可以辨別，這一點(diǎn)是HE染色、Masson染色等噬色性染色所無(wú)法比擬的。比較分析HE染色和免疫熒光技術(shù)對(duì)中性粒細(xì)胞呈現(xiàn)情況來(lái)看，燙傷早期1d和3dHE染色計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)量要低于免疫熒光技術(shù)計(jì)數(shù)數(shù)量，這可能由于炎癥早期中性粒細(xì)胞多以2～3分葉核細(xì)胞為主，在HE染色下比較難以鑒別為中性粒細(xì)胞，從而被漏計(jì)數(shù)；而免疫熒光技術(shù)摒棄了這個(gè)缺點(diǎn)，只要存在MPO陽(yáng)性就為中性粒細(xì)胞，大大提高了敏感度和特異性。燙傷中期5d和7dHE染色計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)量和免疫熒光技術(shù)計(jì)數(shù)數(shù)量基本相同，這可能是由于HE染色中一些裸核中性粒細(xì)胞也被計(jì)數(shù)其中，裸核中性粒細(xì)胞是“死亡”的中性粒細(xì)胞沒(méi)有計(jì)數(shù)意義，而在免疫熒光技術(shù)計(jì)數(shù)中裸核中性粒細(xì)胞無(wú)免疫熒光表達(dá)而不被計(jì)數(shù)，此階段HE染色計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)量和免疫熒光技術(shù)計(jì)數(shù)數(shù)量雖基本一致，但HE染色中把一些死亡中性粒細(xì)胞也包括在內(nèi)，這是一種偽敏感度提高。比較分析HE染色和免疫熒光技術(shù)對(duì)巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)情況來(lái)看，HE染色中，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞較圓較大，核圓大居中，而在免疫熒光技術(shù)F4/80陽(yáng)性的為巨噬細(xì)胞，通過(guò)多人對(duì)2種染色技術(shù)中巨噬細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)，對(duì)比兩者數(shù)據(jù)來(lái)看，HE染色計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差明顯高于免疫熒光技術(shù)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差，這一點(diǎn)說(shuō)明免疫熒光技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和易辨別性，大大降低不同人對(duì)巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差。比較分析HE染色和免疫熒光技術(shù)對(duì)肌成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)情況來(lái)看，HE染色基本無(wú)法確認(rèn)肌成纖維細(xì)胞，α-SMA陽(yáng)性是肌成纖維細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)肌成纖維細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)是不言而喻的。

本實(shí)驗(yàn)表明，MPO陽(yáng)性率燙傷愈合過(guò)程與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，隨著燙傷時(shí)間延長(zhǎng)其陽(yáng)性率逐漸下降以至消失，1d表達(dá)高峰。F4/80陽(yáng)性率在燙傷愈合過(guò)程中，隨著燙傷時(shí)間延長(zhǎng)呈單峰狀分布，5d表達(dá)高峰。α-SMA陽(yáng)性率燙傷過(guò)程中呈正相關(guān)，隨著燙傷時(shí)間延長(zhǎng)其陽(yáng)性率逐漸上升，14d表達(dá)高峰。皮膚燙傷1d MPO陽(yáng)性率＞50%，F(xiàn)4/80陽(yáng)性率＜5%，無(wú)α-SMA表達(dá)；皮膚燙傷3d MPO陽(yáng)性率≈50%，F(xiàn)4/80陽(yáng)性率和α-SMA陽(yáng)性率均＜5%；皮膚燙傷5d MPO陽(yáng)性率、F4/80陽(yáng)性率及α-SMA陽(yáng)性率三者均＜30%；皮膚燙傷7d MPO陽(yáng)性率＜15%，F(xiàn)4/80陽(yáng)性率＜25%，α-SMA陽(yáng)性率＞40%；皮膚燙傷10d無(wú)MPO表達(dá)，F(xiàn)4/80陽(yáng)性率＜20%，α-SMA陽(yáng)性率≈50%；皮膚燙傷14d無(wú)MPO表達(dá)，F(xiàn)4/80陽(yáng)性率＜10%，α-SMA陽(yáng)性率＞60%。通過(guò)以上數(shù)據(jù)綜合判斷皮膚燙傷時(shí)間具有很高準(zhǔn)確性。

4 小結(jié)

皮膚燙傷時(shí)間推斷是國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)研究的空白領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)皮膚燙傷愈合過(guò)程中急性期、增生期和重建期三種主要的細(xì)胞，通過(guò)對(duì)其陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)和與普通HE染色比較，發(fā)現(xiàn)可以大幅度提高燙傷時(shí)間推斷準(zhǔn)確性，檢測(cè)方法特異性敏感性都顯著高于以往方法。

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（責(zé)任編輯：于 萍）

DF795.4

A

2014-01-05

公安部重點(diǎn)攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2011ZDYJXJXY005）；遼寧省博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（編號(hào)：20141048）。

任鵬（1985-），男，遼寧錦州人，中國(guó)刑警學(xué)院法醫(yī)系助教，碩士，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。