林 琎,王紅艷,王開運(yùn)*,范維娣,許 輝,劉 杰(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東 泰安71018；.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥環(huán)境毒理研究中心,山東 泰安 71018；.山東棉花研究中心,山東 濟(jì)南 50100；.山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司,山東 濟(jì)南 50100)

氟吡菌胺對(duì)斑馬魚的毒性效應(yīng)

林 琎1,2,王紅艷3,王開運(yùn)1,2*,范維娣2,許 輝4,劉 杰4(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東 泰安271018；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥環(huán)境毒理研究中心,山東 泰安 271018；3.山東棉花研究中心,山東 濟(jì)南 250100；4.山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司,山東 濟(jì)南 250100)

采用斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)和傳統(tǒng)毒理學(xué)方法, 研究了氟吡菌胺對(duì)斑馬魚胚胎、成魚及仔魚的毒性效應(yīng).結(jié)果發(fā)現(xiàn),氟吡菌胺對(duì)3個(gè)階段斑馬魚均具有致死能力,對(duì)仔魚LC50(48h)值為0.204mg/L,成魚LC50(96h)為0.286mg/L,幼魚LC50(96h)為1.489mg/L.研究表明,0.0596mg/L以上濃度的氟吡菌胺對(duì)斑馬魚胚胎均有一定程度的致死效應(yīng),高濃度處理組胚胎出現(xiàn)心包囊腫、卵黃囊不吸收、黑色素沉積少及魚體彎曲等癥狀;氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚進(jìn)行14d暴露后,處理組成魚體重下降,產(chǎn)卵量減少,有效卵量降低; 0.0298mg/L處理組144h子代仔魚存活率雖然比較高,但存活魚大部分出現(xiàn)心包囊腫、體彎曲等畸形.上述結(jié)果說(shuō)明,水體中殘留的氟吡菌胺對(duì)于斑馬魚各生命階段的生長(zhǎng)發(fā)育均具有潛在的危害.

氟吡菌胺；斑馬魚；胚胎；成魚；急性毒性

氟吡菌胺(fluopicolide)化學(xué)名稱為 2,6-二氯-N-[(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基)甲基]苯甲酰胺[1],是德國(guó)拜耳公司開發(fā)的一種新型苯甲酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑,對(duì)各種作物的霜霉病、晚疫病、疫病等均有良好的防治效果,其主要作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞間的特異性蛋白,對(duì)病原菌的各主要形態(tài)均有很好的抑制活性[2-3].拜耳公司用氟吡菌胺和強(qiáng)內(nèi)吸傳導(dǎo)性殺菌劑霜霉威鹽酸鹽復(fù)配成商品制劑銀法利,因其見效快和耐雨水沖刷的特點(diǎn)贏得許多農(nóng)民的喜愛,自2006年在中國(guó)上市以來(lái),在番茄、辣椒、馬鈴薯、西瓜、黃瓜、葡萄、煙草上均有使用報(bào)道[4-7].住友化學(xué)美國(guó)分公司生產(chǎn)的氟吡菌胺已經(jīng)登記用于水果、蔬菜和田間作物,以及草皮和觀賞植物等非作物使用.美國(guó)環(huán)保署也已經(jīng)對(duì)氟吡菌胺啟動(dòng)公開審議,預(yù)計(jì)氟吡菌胺的審議在 2021年完成[8]. 氟吡菌胺對(duì)哺乳動(dòng)物毒性為:大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮 LD50> 5000mg/kg,對(duì)兔皮膚無(wú)刺激性,兔眼睛有輕度刺激性,豚鼠皮膚無(wú)致敏性,對(duì)兔、大鼠無(wú)潛在致畸性,對(duì)大鼠無(wú)致癌作用;氟吡菌胺對(duì)環(huán)境生物急性毒性為:山齒鶉急性經(jīng)口 LD50>2250mg/kg,鴨急性 經(jīng) 口 LD50>2250mg/kg,虹 鱒 魚 LC50= 0.36mg/L(96h),藍(lán)鰓太陽(yáng)魚LC50=0.75mg/L(96h),大型溞 EC50>1.8mg/L(48h),水藻 EC50>4.3mg/L (72h), 蚯蚓 LC50>1000mg/kg(14d),蜜蜂觸殺LD50>100mg/只[9];綜上所述,氟吡菌胺對(duì)蜜蜂、鳥和水藻的急性毒性均為低毒,對(duì)大型溞為中毒,而對(duì)兩種魚的急性毒性則為高毒.目前,氟吡菌胺對(duì)水生生物的研究主要集中在急性毒性方面,其對(duì)魚類繁殖和生長(zhǎng)發(fā)育的影響尚未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)采用EPA和國(guó)際OECD認(rèn)可的測(cè)定單一化學(xué)物毒性實(shí)驗(yàn)用魚——斑馬魚為試驗(yàn)材料[10-12],觀察研究了氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚、胚胎及仔魚生長(zhǎng)發(fā)育的影響,以期為氟吡菌胺的水生生物毒理實(shí)驗(yàn)研究及其安全使用提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BM2100數(shù)碼生物顯微鏡,PQX-330A-3H人工氣候箱,孵化器, 5L玻璃水族箱,曝氣裝置,微量移液槍.

96%氟吡菌胺(CAS號(hào):239110-15-7)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥環(huán)境毒理研究中心提供,氟吡菌胺用寧乳-34和黃原膠助溶后,用超純水配制成1000mg/L儲(chǔ)備液備用,本實(shí)驗(yàn)使用的助溶劑濃度不高于0.1mg/L,實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室制備的超純水.

1.2 受試生物

野生型斑馬魚成魚和 3個(gè)月大的幼魚均購(gòu)自泰安市于氏水族館.斑馬魚成魚雌魚抽檢體長(zhǎng)為(4.32±0.026)cm,體重為(0.749±0.0491)g,雄魚抽 檢 體 長(zhǎng) (4.61±0.031)cm,體 重 為 (0.614± 0.0615)g,3個(gè)月大的幼魚抽檢體長(zhǎng)為(2.08± 0.12)cm,體重為(0.060±0.012)g;斑馬魚成魚購(gòu)入后雌雄分開飼養(yǎng)在超純水中,水中溶解氧大于5.8mg/L,用加熱棒和光照恒溫箱控制溫度為28℃,光周期為 14h:10h(晝/夜).每日早晚各喂食一次經(jīng)紫外消毒處理過的紅線蟲或孵化后的豐年蝦幼體,每次喂食5min后將剩余的餌料和糞便及時(shí)吸出,每日換水 1/3.繁殖前一天晚上將雌雄斑馬魚(雌雄斑馬魚數(shù)量比約為1:2)魚缸靠近,次日凌晨合缸,在魚缸底部放置隔離網(wǎng),以防斑馬魚自食其卵,給光讓其產(chǎn)卵受精.利用虹吸法收集魚卵,用超純水迅速清洗受精卵以除去其間混有的雜質(zhì)和污物,剔除受損受精卵或未受精卵,選取卵裂期的受精卵供試.將清洗過的正常受精卵分為兩部分:一部分用作胚胎實(shí)驗(yàn);另一部分放在28℃人工氣候箱中孵化,待仔魚游泳平衡后用于仔魚暴露實(shí)驗(yàn).斑馬魚成魚和幼魚試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)水簇箱中馴養(yǎng)至少 7d,溫度 24～28℃,試驗(yàn)前1d不喂食.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 三個(gè)階段斑馬魚急性毒性試驗(yàn) 對(duì)斑馬魚成魚、3個(gè)月大幼魚的急性毒性試驗(yàn)依據(jù)OECD203標(biāo)準(zhǔn)方法[13]進(jìn)行,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別設(shè)定試驗(yàn)濃度,幼魚為 1.00,1.20,1.40,1.60, 1.80mg/L,成 魚 為 0.0596,0.121,0.246,0.499, 1.012mg/L,每個(gè)試驗(yàn)濃度重復(fù)3次,在5L的燒杯中,放入4L的藥液和10條魚.對(duì)剛具有平衡能力的仔魚,其急性毒性試驗(yàn)使用靜水法生物測(cè)試進(jìn)行了稍加修改.試驗(yàn)濃度為 0.120,0.150,0.188, 0.234,0.293mg/L,每個(gè)濃度重復(fù)3次,在100mL的燒杯中裝入50mL供試藥液和10條仔魚.

幼魚和成魚試驗(yàn)持續(xù)暴露 96h,仔魚試驗(yàn)暴露 48h,做最高濃度相應(yīng)的溶劑對(duì)照和空白對(duì)照.試驗(yàn)藥液每24h更新一次,以保持藥劑濃度.人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)溫度為(28±1)℃;濕度:70%;光照周期:14h:10h.每24h觀察一次成魚和幼魚的行為反應(yīng),隨時(shí)記錄成魚和幼魚的死亡數(shù)和中毒癥狀,判斷死亡的標(biāo)準(zhǔn)是用玻璃棒碰觸其尾部無(wú)明顯運(yùn)動(dòng).仔魚的中毒癥狀每24h用顯微鏡觀察一次,判斷死亡的標(biāo)準(zhǔn)是沒有心跳,在急性毒性試驗(yàn)過程中,均不喂食,死亡個(gè)體立即清除.

1.3.2 胚胎體外直接染毒 按照 OECD212[14]方法,設(shè)計(jì)胚胎毒性試驗(yàn).在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了 9個(gè)測(cè)試濃度,分別為 0.0149,0.0298,0.0596, 0.149,0.298,0.350,0.595,1.012,1.720mg/L.胚胎受精后約1h轉(zhuǎn)移到盛有2mL試驗(yàn)藥液的24孔板中,每孔加入一枚受精卵.以超純水作為空白對(duì)照,并設(shè)最高濃度相對(duì)應(yīng)的溶劑對(duì)照.每個(gè)試驗(yàn)濃度20枚卵.試驗(yàn)藥液每24h更新一次,以保持氟吡菌胺的濃度.觀察 24h胚胎自主運(yùn)動(dòng), 檢查 48h、72h、96h胚胎的心跳速率和72h孵化數(shù),120h仔魚體長(zhǎng).每24h通過顯微鏡觀察胚胎形態(tài)并拍照. 1.3.3 成魚短期重復(fù)濃度試驗(yàn) 根據(jù) OECD204準(zhǔn)則[15],稍作修改,進(jìn)行成魚短期重復(fù)濃度試驗(yàn),即連續(xù)14d進(jìn)行氟吡菌胺暴露試驗(yàn),其染毒濃度為 0.0149,0.0298,0.0596,0.149,0.298mg/L,為減少加藥過程對(duì)斑馬魚的影響,采用靜態(tài)方式染毒.并設(shè)空白對(duì)照和最高濃度的溶劑對(duì)照.試驗(yàn)用成年斑馬魚隨機(jī)分組,將10條雌魚和10條雄魚分別稱重后放入5個(gè)不同濃度藥劑,染毒14d,染毒期間每天早晚各喂食1次;染毒結(jié)束后,將剩余存活親魚稱重后,將1條雌魚和1條雄魚轉(zhuǎn)入盛有5L清水的孵化器中,孵化器底部有紗網(wǎng)隔離,給光刺激每一對(duì)單獨(dú)產(chǎn)卵,產(chǎn)卵結(jié)束后取出親魚,檢查每對(duì)親魚的產(chǎn)卵量,24h檢查無(wú)效卵量,72h檢查孵化數(shù), 144h檢查子代斑馬魚的存活數(shù)和畸形數(shù).

1.4 試驗(yàn)濃度檢測(cè)分析

在對(duì)斑馬魚成魚和幼魚的急性毒性試驗(yàn)過程中,依次在試驗(yàn)第0h和96h時(shí)對(duì)試驗(yàn)每組濃度的1個(gè)平行樣進(jìn)行質(zhì)量濃度分析,重復(fù)2次.取氟吡菌胺水樣40mL于150mL分液漏斗中,用15mL二氯甲烷萃取3次,合并有機(jī)相45mL于圓底燒瓶中,38℃減壓濃縮至干,再用20mL甲醇溶解,進(jìn)行液相分析.

液相分析條件參考張小軍的方法[16]:安捷倫1200HPLC,色 譜 柱 Agilent Zorbaysb-C18 (4.6mm×150mm×5μm),紫外檢測(cè)器,流動(dòng)相為甲醇:水=75:25;流速1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)265nm;進(jìn)樣體積20μL.

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用寇氏法分析,分別計(jì)算氟吡菌胺對(duì)斑馬魚 3個(gè)階段的急性毒性?半致死濃度 LC50值及其95%置信區(qū)間.

用DPS V13.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行ANOVA分析,將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.本文毒性數(shù)據(jù)均表示為:與空白對(duì)照組相比,所得試驗(yàn)結(jié)果呈顯著性差異(P<0.05*)或極顯著差異(P<0.01**).

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)液質(zhì)量濃度分析結(jié)果

斑馬魚成魚和幼魚的急性毒性試驗(yàn)過程中,各濃度暴露液實(shí)際質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度比較結(jié)果見表1.氟吡菌胺保留時(shí)間為7.017min.由表 1可知,試驗(yàn)過程中氟吡菌胺的實(shí)際質(zhì)量濃度與試驗(yàn)設(shè)計(jì)理論濃度誤差范圍均在 80%～120%內(nèi)(表1),符合OECD203試驗(yàn)準(zhǔn)則有關(guān)質(zhì)量濃度要求,因此本研究中氟吡菌胺的暴露液質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)可采用理論設(shè)計(jì)濃度.

表1 氟吡菌胺質(zhì)量濃度檢測(cè)分析Table 1 The concentration detection and analysis of fluopicolide in test

2.2 三個(gè)階段斑馬魚急性毒性結(jié)果

在氟吡菌胺對(duì) 3個(gè)階段斑馬魚的急性毒性試驗(yàn)過程中,空白對(duì)照及助劑對(duì)照受試魚在試驗(yàn)期間未出現(xiàn)死亡,各項(xiàng)體征正常.氟吡菌胺對(duì)3個(gè)階段的斑馬魚均有致死效應(yīng)(表2),仔魚LC50(48h)值為0.204mg/L,成魚LC50(96h)為0.286mg/L,幼魚LC50(96h)為1.489mg/L,表明氟吡菌胺對(duì)仔魚和成魚毒性高于對(duì)幼魚的毒性.換而言之,對(duì)氟吡菌胺,仔魚最敏感,成魚次之,幼魚最不敏感.

表2 氟吡菌胺對(duì)3個(gè)階段斑馬魚急性毒性結(jié)果Table 2 The acute-toxicity result of fluopicolide to three stages zebrafish

3個(gè)階段斑馬魚對(duì)氟吡菌胺呈現(xiàn)出相似中毒癥狀:低濃度藥劑暴露期間,魚側(cè)翻肚皮在水面游動(dòng),魚肚發(fā)白.中高濃度藥劑暴露開始時(shí),即出現(xiàn)快速游動(dòng),上下旋轉(zhuǎn)游動(dòng),表現(xiàn)異常興奮,4h即側(cè)翻游,12h后靜止不游動(dòng),玻棒碰觸尾部仍可迅速游開;最后出現(xiàn)魚體下沉、游動(dòng)減弱等,最終死亡.

本試驗(yàn)得出,氟吡菌胺對(duì)斑馬魚幼魚LC50(96h)值為 1.489mg/L,按照化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則劃分的毒性等級(jí),其對(duì)魚類急性毒性為中毒;而 EPA數(shù)值顯示:氟吡菌胺對(duì)虹鱒魚LC50(96h)值為0.36mg/L,對(duì)魚類急性毒性結(jié)果為高毒[17].因在毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中所用魚的種類不同,本試驗(yàn)的LC50(96h)值是EPA數(shù)值的4.1倍,毒性等級(jí)也不同.因此,在農(nóng)藥對(duì)環(huán)境安全評(píng)價(jià)過程中,不但要考慮農(nóng)藥本身的成份和乳化劑等,還要考慮評(píng)價(jià)用魚種類的不同導(dǎo)致的結(jié)果差異性.

2.2 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚胚胎的致死毒性效應(yīng)

斑馬魚胚胎暴露在含氟吡菌胺的水環(huán)境中,胚胎出現(xiàn)死亡,表現(xiàn)為48h卵凝結(jié)、72h已成形但無(wú)法從卵殼中脫出且無(wú)心跳、胚胎趨于死亡或者已經(jīng)死亡,對(duì)不同濃度氟吡菌胺引起的斑馬魚致死效應(yīng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1.

由圖1可知,在氟吡菌胺作用下,斑馬魚胚胎的死亡率隨其濃度的增大而增強(qiáng), 0.0596mg/L以上濃度的氟吡菌胺對(duì)斑馬魚胚胎均有一定程度的致死效應(yīng);當(dāng)氟吡菌胺濃度高于 0.35mg/L時(shí),胚胎的死亡率明顯增大,濃度達(dá)1.72mg/L時(shí),72h可導(dǎo)致一半以上的受試胚胎死亡,至96h受試胚胎全部死亡.

圖1 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚胚胎的死亡率Fig.1 The Lethal toxicity of Fluopicolide to zebrafish embryo

2.3 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚胚胎的非致死毒性效應(yīng)

圖2 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚胚胎心跳數(shù)的影響Fig.2 Effects of Fluopicolide to zebrafish embryo heartbeats

將斑馬魚胚胎在系列濃度氟吡菌胺中暴露48h時(shí),空白對(duì)照胚胎有自主運(yùn)動(dòng),平均心跳數(shù)在(95±1.7)次/min,同期所有濃度氟吡菌胺處理的胚胎心跳均比對(duì)照快,暴露72h和96h時(shí),處理胚胎心跳減慢,但仍比對(duì)照胚胎心跳快(圖 2);96h時(shí),0.149mg/L以上濃度氟吡菌胺處理胚胎所孵化仔魚均出現(xiàn)心跳無(wú)規(guī)律、忽快忽慢的癥狀.

72h時(shí),對(duì)照胚胎全部孵化,仔魚體表黑色素比較密集,0.35mg/L濃度氟吡菌胺處理的胚胎孵化率為85.71%,1.720mg/L濃度氟吡菌胺處理的胚胎均未孵化出殼,但可見已成魚形,且均表現(xiàn)出明顯的心包囊腫;且經(jīng)氟吡菌胺處理的胚胎所孵化出的仔魚體表黑色素均比較稀少(圖3).

圖3 72h仔魚Fig.3 The zebrafish larvae at 72h

96h時(shí),0.298mg/L及以下濃度氟吡菌胺處理的胚胎全部孵化,但均有輕微的心包囊腫和卵黃囊不吸收,0.35mg/L以上濃度氟吡菌胺處理后孵化出的仔魚均出現(xiàn)明顯心包囊腫和卵黃囊不吸收,且仔魚體表黑色素仍然比對(duì)照稀少(圖4).

圖4 96h仔魚Fig.4 The zebrafish larvae at 96h

120h時(shí),0.0596mg/L及以下濃度的氟吡菌胺處理的胚胎孵化出的仔魚未出現(xiàn)心包囊腫的癥狀,且孵化出的仔魚平均體長(zhǎng)都比對(duì)照長(zhǎng); 0.149mg/L及以上濃度的氟吡菌胺處理的胚胎孵化出的仔魚均出現(xiàn)不同程度的心包囊腫、卵黃囊不吸收和脊柱彎曲等癥狀,且孵化出的仔魚平均體長(zhǎng)都比對(duì)照短(圖5).表明低濃度氟吡菌胺可促進(jìn)斑馬魚體長(zhǎng)增加,但高濃度氟吡菌胺可造成仔魚出現(xiàn)心包囊腫等癥狀,最終導(dǎo)致處理仔魚體長(zhǎng)比對(duì)照仔魚短.

圖5 120h仔魚Fig.5 The treated zebrafish larvae at 120h

在斑馬魚胚胎暴露試驗(yàn)中,可將72h孵化抑制率和120h心包囊腫作為氟吡菌胺的毒理學(xué)終點(diǎn);本試驗(yàn)中,72h孵化抑制率達(dá)到 100%的最低濃度為 1.720mg/L,120h時(shí)出現(xiàn)全致畸效應(yīng)的最低濃度為0.149mg/L.

120h時(shí)將氟吡菌胺處理胚胎后存活仔魚放入清水中進(jìn)行恢復(fù),低濃度無(wú)中毒癥狀的仔魚均可正常生存,高濃度有中毒癥狀的仔魚其癥狀不可消除,且心跳減緩,144h后均死亡.

美國(guó)EPA數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示氟吡菌胺的生物富集系數(shù)為 121,屬于中等富集性農(nóng)藥[18],因該藥劑主要施用于蔬菜和水果,具有強(qiáng)內(nèi)吸性,在施用過程中,不僅通過內(nèi)吸進(jìn)入植株,而且還可通過各種農(nóng)耕措施和雨水沖刷流入水體,導(dǎo)致水體污染.目前,國(guó)內(nèi)對(duì)該藥的殘留尚無(wú)報(bào)道,歐盟及韓國(guó)、日本2011年時(shí)規(guī)定氟吡菌胺最大殘留限量,其范圍在 0.01～0.3mg/kg之間[19],而本研究結(jié)果表明,0.0298mg/L的氟吡菌胺處理胚胎后,其孵化的仔魚心跳數(shù)比對(duì)照快,孵化出的仔魚體長(zhǎng)也比對(duì)照長(zhǎng),說(shuō)明該濃度氟吡菌胺已經(jīng)影響了斑馬魚心臟發(fā)育和仔魚體長(zhǎng).斑馬魚屬于脊椎動(dòng)物,與人類基因的保守度高達(dá)85%[20],考慮到人類及脊椎動(dòng)物的健康,應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)氟吡菌胺施用后相鄰水體的殘留檢測(cè),并注意在水系統(tǒng)相鄰的作物生產(chǎn)區(qū)域慎用該農(nóng)藥.

2.4 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚的毒性效應(yīng)

斑馬魚成魚暴露在不同濃度的氟吡菌胺藥液中14d后,對(duì)照組雌魚和雄魚平均體重分別增加0.1140g和0.0952g,處理組雌魚和雄魚平均體重均有減少,其中0.0298mg/L濃度處理的雌魚和雄魚體重減少最多,減少量分別達(dá)到原體重的38.36%和38.31%(圖6);

圖6 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚14d后體重的影響Fig.6 Effects of fluopicolide to the adult zebrafish body weight

暴露 14d后,處理組雌魚和雄魚均有死亡個(gè)體,死亡數(shù)與濃度成正比,且雄魚死亡數(shù)均高于雌魚(圖 7),說(shuō)明氟吡菌胺對(duì)雄魚毒性高于雌魚.對(duì)照組成魚平均產(chǎn)卵量(246.3±16.1)個(gè)/對(duì),有效卵率為95.60%,72h有效卵孵化率為100%,144h子代仔魚全部存活,無(wú)畸形.處理組成魚平均每對(duì)產(chǎn)卵量均低于對(duì)照組,無(wú)效卵量多,72h有效卵孵化率低,0.0298mg/L處理組144h子代仔魚存活率雖然比較高,但存活魚也大部分出現(xiàn)心包囊腫、體彎曲等畸形(表3).

在氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚短期重復(fù)濃度試驗(yàn)和胚胎體外直接染毒試驗(yàn)結(jié)果中,仔魚均出現(xiàn)心包囊腫和卵黃囊不吸收,這是氟吡菌胺所致典型癥狀,可作為其毒性學(xué)觀察終點(diǎn).

圖7 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚死亡數(shù)的影響Fig.7 Effects of Fluopicolide to the adult zebrafish mortality

表3 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚的繁殖毒性Table 3 The reproductive toxicity of fluopicolide to the adult zebrafish

在成魚試驗(yàn)中, 0.0298mg/L濃度氟吡菌胺處理的雌魚和雄魚體重減少最多,14d后親魚即出現(xiàn)3雄1雌的死亡,且有效卵率和有效卵孵化率也比對(duì)照低.由此可知,氟吡菌胺在水體中濃度超過0.0298mg/L時(shí),即會(huì)對(duì)斑馬魚胚胎、仔魚的生長(zhǎng)發(fā)育及成魚的繁殖造成影響.因此,建議其在近魚類養(yǎng)殖區(qū)附近的水體中最大殘留限量不要超過0.0298mg/L,約為歐盟等規(guī)定殘留限量范圍最大值的1/10.

3 結(jié)論

3.1 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚仔魚、成魚及幼魚3個(gè)階段斑馬魚急性毒性結(jié)果為,對(duì)仔魚LC50(48h)值為0.204mg/L,成魚LC50(96h)為0.286mg/L,幼魚LC50(96h)為1.489mg/L.

3.2 當(dāng)氟吡菌胺濃度達(dá)1.72mg/L時(shí),72h可導(dǎo)致一半以上的受試胚胎死亡,96h受試胚胎全部死亡;氟吡菌胺處理斑馬魚胚胎后,出現(xiàn)了心包囊腫、心跳無(wú)規(guī)律、忽快忽慢、卵黃囊不吸收、黑色素沉積少及魚體彎曲等癥狀;其中,心包囊腫和卵黃囊不吸收是其典型癥狀,可作為其毒理學(xué)觀察終點(diǎn).

3.3 氟吡菌胺對(duì)斑馬魚雄魚毒性高于雌魚.氟吡菌胺對(duì)斑馬魚成魚進(jìn)行14d暴露后,成魚體重下降,產(chǎn)卵量減少,有效卵量降低;子代仔魚存活率下降,且存活子代仔魚大部分出現(xiàn)心包囊腫、體彎曲等畸形.

3.4 氟吡菌胺在水體中濃度超過0.0298mg/L時(shí),即會(huì)對(duì)斑馬魚胚胎、仔魚的生長(zhǎng)發(fā)育及成魚的繁殖造成影響.建議其在近魚類養(yǎng)殖區(qū)附近的水體中最大殘留限量不要超過0.0298mg/L.

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致謝：在此,謹(jǐn)對(duì)慕衛(wèi)老師在試驗(yàn)方案和文章修改方面給予的悉心幫助表示衷心的感謝.

Toxic effects of fluopicolide on zebrafish.

LIN Jin1,2, WANG Hong-yan3, WANG Kai-yun1,2*, FAN Wei-di2, XU Hui4,

LIU Jie4(1.College of Plant Protection, Shandong Agriculture University, Taian 271018, China；2.Center of Pesticide Environmental Toxicology, Shandong Agriculture University, Taian 271018, China；3.Shandong Cotton Research Center, Jinan 250100, China；4.United Pesticide Industry Co., Ltd., Shandong Province, Jinan 250100, China). China Environmental Science, 2014,34(12)：3230～3236

The zebrafish embryos technology and traditional toxicology methods were used to determined the toxicity of fluopicolide to zebrafish embryos、adult fish and larvae. Fluopicolide had lethal capabilities to the three stages of zebrafish with the LC50(48h) values to larvae and LC50(96h) to adult fish and juvenile was 0.204mg/L, 0.286mg/L and 1.489mg/L. 0.0596mg/L or more concentrations fluopicolide have a certain degree of lethal effect to zebrafish embryos, and the embryos which were treated with high concentrations displayed many of the symptoms, such as pericardial cyst, yolk sac does not absorb, less melanin deposition and fish bending. After 14days exposure with fluopicolide, the adult zebrafishs expressed the following symptoms: weight loss, reduction in fecundity, the amount of effective eggs were reduced; After treated by 0.0298mg/L fluopicolide, though 144h offspring larval’s survival relatively high, but most surviving fish has still emerged as deformity: pericardial edema and abnormal body bending, etc. Fluopicolide residue in water have the potential hazards to the growth and development of each life stage of zebrafish.

fluopicolide；zebrafish；embryo；adult fish；acute toxicity

X171.5

A

1000-6923(2014)12-3230-07

林 琎(1978-),女,四川三臺(tái)人,實(shí)驗(yàn)師,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生,研究方向?yàn)檗r(nóng)藥毒理及有害生物抗藥性.發(fā)表論文8篇.

2014-03-10

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2011BAE06B02)

* 責(zé)任作者, 教授, kywang@sdau.edu.cn