高佳佳等

摘 要 膠乳轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Inv）是控制橡膠樹膠乳蔗糖代謝和影響膠乳（橡膠）產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。已有研究證實(shí)了膠乳轉(zhuǎn)化酶屬于中性/堿性轉(zhuǎn)化酶。本研究以熱研7-33-97（2n=36）為材料制備葉片細(xì)胞染色體標(biāo)本，采用熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）對膠乳轉(zhuǎn)化酶基因HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3進(jìn)行了染色體物理定位的初步研究。結(jié)合核型分析，初步確定HbNIN1基因位于5號染色體的長臂上，其信號位點(diǎn)到著絲粒的百分距離為33.1；HbNIN2基因位于2號染色體的長臂上，其信號位點(diǎn)到著絲粒的百分距離為 35.7；HbNIN3基因位于3號染色體的短臂上，其信號位點(diǎn)到著絲粒的百分距離為40.42。由此揭示了該基因家族在染色體上的位置和分布特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；轉(zhuǎn)化酶；HbNIN1；HbNIN2；HbNIN3；熒光原位雜交

中圖分類號 S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Chromosome Location of HbNIN Family Gene

from Hevea brasiliensis

GAO Jiajia1，2， WANG Ying1， GAO Heqiong1， ZHU Wen1， ZHUANG Nansheng1*

1 Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource/College of Agronomy， Hainan University， Haikou，

Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Latex invertase acts as one of the key enzymes regulating the sucrose metabolism and determining the latex yield. It is verified that latex invertase belongs to the category of neutral/alkaline invertases. In this study， chromosome specimens were prepared with immature leaves of Reyan7-33-97， FISH was used to physically locate HbNIN1、HbNIN2 and HbNIN3 gene of H. brasiliensis. The results showed that HbNIN1 gene was located on the long arm of chromosome 5， the percent distances from the gene locus to centromere was 33.1； the HbNIN2 gene was located on the long arm of chromosome 2， the percent distances from the gene locus to centromere was 35.7； the HbNIN3 gene was located on the short arm of Chromosome 3， the percent distances from the gene locus to centromere was 40.42. It reveals the location and distribution of the gene family on the chromosomes.

Key words Hevea brasiliensis； Invertase； HbNIN1； HbNIN2； HbNIN3； FISH

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.008

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是一種重要的產(chǎn)膠植物，是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物。橡膠的生物合成是在一種特化的細(xì)胞（乳管）中進(jìn)行[1]，其原料是蔗糖，而蔗糖并不能直接被利用，必須在蔗糖合酶或轉(zhuǎn)化酶的作用下才能被進(jìn)一步利用。蔗糖合酶主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在尿苷二磷酸催化下，可逆地催化蔗糖裂解為尿苷二磷酸和果糖；轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Inv）可以催化蔗糖不可逆的裂解形成葡萄糖和果糖，是植物降解蔗糖的關(guān)鍵酶[2-4]。Barratt等[5]發(fā)現(xiàn)在糖代謝過程中轉(zhuǎn)化酶的作用要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蔗糖合酶。根據(jù)最適酶活pH值的不同可將轉(zhuǎn)化酶分為酸性轉(zhuǎn)化酶（Acid invertase，Ac-Inv）和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶（Neutral or alkaline invertase，N/A-Inv）兩類。Tupy[6-10]研究證實(shí)膠乳轉(zhuǎn)化酶是橡膠樹膠乳代謝的限速酶；該酶位于細(xì)胞質(zhì)，最適的酶活pH值為7.25～7.40，屬于中性/堿性轉(zhuǎn)化酶，是決定橡膠膠乳產(chǎn)量的關(guān)鍵酶。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院唐朝榮課題組已先后克隆了3個(gè)橡膠樹膠乳轉(zhuǎn)化酶基因的全長cDNA，其中劉術(shù)金[11]克隆了2個(gè)，分別命名為HbNIN1、HbNIN2序列，已提交GenBank（GU573728和GU573727）。而HbNIN3也已克隆出但尚未發(fā)表。劉術(shù)金[11]研究了在不同條件下HbNIN1與HbNIN2在橡膠膠乳中的表達(dá)特性。戚繼艷等[12]分析了HbNIN2基因在巴西橡膠樹嫩皮和中脈中的 RNA原位雜交。藍(lán)基賢[13]利用Western blot技術(shù)研究了在蛋白水平HbNIN2基因的表達(dá)情況。但是關(guān)于這3個(gè)基因在橡膠染色體上的具體位置尚未明確。

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。該技術(shù)除了保持其他原位雜交能夠確定探針?biāo)s交的具體位點(diǎn)，精確地定位目的基因[14-l5]的特點(diǎn)外，還具備安全、快速、靈敏度高、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高等優(yōu)點(diǎn)[16]。本實(shí)驗(yàn)利用熒光原位雜交技術(shù)對HbNIN1、HbNIN2及HbNIN3基因進(jìn)行了物理定位。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以巴西橡膠樹無性系熱研7-33-97（2n=36）為材料制備葉片細(xì)胞染色體標(biāo)本。采自海南大學(xué)（儋州校區(qū)）農(nóng)學(xué)院基地。

Taq DNA聚合酶和DNA Marker購自TaKaRa公司；DNA快速純化/回收采用北京鼎國公司的DNA快速純化/回收試劑盒；果膠酶購于Serva；纖維素酶（Cellulase“Onozuka”R-10）購于Japan Yakult；地高辛切口平移試劑盒（DIG-NiCk Translation Mix for in situ probes）購于Roche公司；Jackson的Alexa Fluor 488-IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin、Alexa Fluor 488-AffiniPure Mouse Anti-Rabbit IgG、Alexa Fluor 488-AffiniPure Rabbit Anti-Mouse IgG；DAPI購于Sigma公司；引物合成由Invitrogen（上海）公司完成。

1.2 方法

1.2.1 染色體標(biāo)本的制備 染色體標(biāo)本的制備主要參考高和瓊[17]等的方法。將酶液濃度提高為5%纖維素酶（Lellulase“Onozuka”R-10，Japan Yakult）和4%果膠酶（Serva，Easiseal）混合液，37 ℃酶解7 h左右（根據(jù)葉片大小不同以及材料的固定時(shí)間不同，酶解時(shí)間有所差異）。

1.2.2 基因片段的PCR擴(kuò)增與回收 本研究用于HbNIN基因家族基因片段擴(kuò)增的DNA模板及引物序列均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所唐朝榮課題組惠贈（表1）：包括用于HbNIN1、HbNIN2基因組片段擴(kuò)增的基因組DNA和引物，以及用于HbNIN3基因擴(kuò)增的cDNA及引物。經(jīng)如下程序擴(kuò)增：94 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 3.5 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。之后采用北京鼎國公司的DNA快速純化/回收試劑盒對擴(kuò)增片段進(jìn)行純化回收，具體操作參照產(chǎn)品說明書。由于HbNIN3基因序列未發(fā)表，暫時(shí)不便公布序列及引物信息。

1.2.3 探針的制備 采用Roche公司的地高辛切口平移試劑盒（DIG-Nick Translation Mix for in situ Probe）標(biāo)記制備探針，具體操作參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。參考盧圣棟[18]乙醇沉淀純化法純化探針。探針標(biāo)記完成后，向20 μL探針標(biāo)記反應(yīng)液中加入10 mg/mL E.coli tRNA 2 μL、10 mg/mL鮭魚精DNA 2 μL和4 mol/L醋酸銨2.5 μL，然后加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后稍離心，置于-70 ℃ 3 h以上。4 ℃下13 000 r/min離心20 min，沉淀探針DNA，去上清，室溫下干燥DNA，再用去離子甲酰胺溶解探針，使探針終濃度為50 ng/μL。

1.2.4 熒光原位雜交 參照邱海燕[19]的方法進(jìn)行熒光原位雜交。為了提高信號檢出率作者對FISH的操作過程稍作修改：染色體標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理中用0.01 mol/L HCl溶液取代2×SSC溶液；采用Alexa Fluor 488抗體代替FITC抗體；將雜交后的洗脫時(shí)間延長至10 min。

1.2.5 圖象檢測與分析 用熒光顯微鏡觀察，Penguin/Proseries Camera systems軟件拍照，用Photoshop軟件進(jìn)行圖片處理。根據(jù)王靜暉等[20]報(bào)道的擴(kuò)增信號位點(diǎn)的百分距離的計(jì)算方法結(jié)合核型分析確定信號位點(diǎn)在染色體上的具體位置。具體計(jì)算方法如下：

擴(kuò)增信號位點(diǎn)的百分距離=

×100

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增

采用中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所唐朝榮課題組惠贈的引物，以巴西橡膠樹基因組為模板，對HbNIN1、HbNIN2基因基因組片段進(jìn)行擴(kuò)增；采用惠贈的模板cDNA及引物進(jìn)行HbNIN3基因片段的擴(kuò)增（圖1）。HbNIN1基因基因組片段長度為950 bp左右（泳道1）；HbNIN2基因基因組片段長度為950 bp左右（泳道3）；HbNIN3基因片段長度為2 000 bp左右（圖1泳道5）。并對HbNIN1、HbNIN2擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，對測得序列與HbNIN1、HbNIN2基因基因組全長進(jìn)行BLAST比對，比對結(jié)果顯示片段相似性都達(dá)99%，這就說明這兩段擴(kuò)增序列確實(shí)為HbNIN1、HbNIN2基因組片段。并對HbNIN1、HbNIN2、HbNIN3擴(kuò)增片段進(jìn)行相互比對，結(jié)果顯示兩兩序列之間沒有相似性，可制備FISH所用探針進(jìn)行3個(gè)基因的物理定位分析。

2.2 探針標(biāo)記的檢測

本研究使用切口平移試劑盒進(jìn)行探針的標(biāo)記，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）。結(jié)果顯示：標(biāo)記后的探針呈彌散的條帶，片段大小主要集中在200～600 bp，且條帶分布均勻。這就說明擴(kuò)增片段已經(jīng)被成功地標(biāo)記，標(biāo)記后的探針長度適宜且分布較均勻，能夠用于后續(xù)的熒光原位雜交。

2.3 HbNIN基因家族FISH結(jié)果與分析

HbNIN基因家族在熱研7-33-97有絲分裂不同時(shí)期的葉片細(xì)胞中均可檢測到雜交信號，其中以出現(xiàn) 2個(gè)雜交信號居多。以高和瓊[21]等報(bào)道的熱研7-33-97的核型為依據(jù)，對這些含有雜交信號位點(diǎn)的中期細(xì)胞進(jìn)行核型分析，得到了如圖2-C、圖3-C和圖4-C所示的核型圖，以及如圖5所示的核型模式圖。HbNIN1基因位于5號染體的長臂上，其信號位點(diǎn)到著絲粒的百分距離為33.1（圖2-C、圖5）；HbNIN2基因位于2號染色體的長臂上，其信號位點(diǎn)到著絲粒的百分距離為35.7（圖3-C、圖5）；HbNIN3基因位于3號染色體的短臂上，其信號位點(diǎn)到著絲粒的百分距離為40.42（圖4-C、圖5）。

2.4 巴西橡膠樹熱研7-33-97核型模式圖

根據(jù)高和瓊[21]得到的巴西橡膠樹熱研7-33-97的核型數(shù)據(jù)制作核型模式圖，圖5為本研究定位的3個(gè)基因HbNIN1、HbNIN2、HbNIN3基因在熱研7-33-97的染色體上的位置分布，由圖5可知，3個(gè)基因位于3條不同的染色體上因此為獨(dú)立基因。

2.5 信號檢出率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究在進(jìn)行了HbNIN1、HbNIN2及HbNIN3基因的雜交時(shí)都觀察了350個(gè)以上的細(xì)胞，并對觀察結(jié)果進(jìn)行了簡單的統(tǒng)計(jì)分析，具體分析結(jié)果見表2。由表2可以看出，3個(gè)基因的信號檢出率都在20%以上，且在所有能夠檢出信號的細(xì)胞中，有2信號位點(diǎn)的細(xì)胞占80%左右，也有少部分細(xì)胞出現(xiàn)1個(gè)信號點(diǎn)及3個(gè)信號點(diǎn)的現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

探針一直是影響雜交效果的重要因素之一，對于基因家族的雜交定位來講，如何通過設(shè)計(jì)不同的探針來進(jìn)行各家族成員之間的有效區(qū)分，是需要首要考慮的問題之一。膠乳轉(zhuǎn)化酶HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3同屬于膠乳轉(zhuǎn)化酶HbNIN基因家族，其中HbNIN1、HbNIN2的cDNA之間同源相似性很高，達(dá)到98%，而HbNIN3與HbNIN1、HbNIN2之間沒有同源性。劉術(shù)金[11]在進(jìn)行HbNIN1、HbNIN2的Southern雜交時(shí)，就選用這2個(gè)基因同源性最低的基因組片段進(jìn)行探針引物的設(shè)計(jì)，并以橡膠樹基因組DNA為模板，成功地?cái)U(kuò)增出這2個(gè)基因的基因組片段，但由于Southern雜交的實(shí)驗(yàn)條件不夠優(yōu)化，導(dǎo)致結(jié)果不夠理想，只能推測這2個(gè)基因?yàn)閱蔚涂截惢?。本研究繼續(xù)采用劉術(shù)金設(shè)計(jì)的探針引物，擴(kuò)增出HbNIN1、HbNIN2基因組片段與劉術(shù)金所擴(kuò)增片段結(jié)果一致。擴(kuò)增片段測序后經(jīng)比對證實(shí)這2個(gè)探針片段的確來自HbNIN1、HbNIN2基因組全長，且2個(gè)片段之間沒有相似性，可以用于FISH制備探針。而由于同家族的HbNIN3基因與HbNIN1、HbNIN2基因之間沒有同源性，因此可以直接以HbNIN3的cDNA序列制備探針進(jìn)行該基因的物理定位研究。探針的長度也是影響雜交效果的因素之一，適宜長度的探針，能夠穿透組織，順利接近靶位置，與靶序列形成穩(wěn)定雙鏈，而且形成的雜交體受環(huán)境影響小，不易被洗脫。李璇[22]認(rèn)為探針長300～500 bp時(shí)可達(dá)到最大的雜交率。余朝文[23]認(rèn)為探針長度在300 bp左右的雜交效果較好。本研究采用切口平移法進(jìn)行探針的標(biāo)記，標(biāo)記后探針長度主要集中在200～600 bp之間，能夠用于后續(xù)的熒光原位雜交。

本研究對3個(gè)HbNIN家族基因進(jìn)行物理定位的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在所有能夠檢測到信號的細(xì)胞中，有2信號位點(diǎn)的細(xì)胞占80%左右，因此認(rèn)為這3個(gè)基因都應(yīng)該屬于單拷貝基因，這與劉術(shù)金的推測是一致的。而有1個(gè)信號位點(diǎn)及3個(gè)位點(diǎn)的細(xì)胞約占所有能夠檢出信號細(xì)胞的16%及4%。筆者認(rèn)為這些可能為不理想的雜交結(jié)果，并初步分析了出現(xiàn)這些不理想現(xiàn)象的原因：（1）出現(xiàn)多個(gè)信號主要是因?yàn)榉翘禺愋噪s交或未雜交上的探針分子，沒有在雜交后的洗脫中被順利除去，造成了假陽性的信號干擾。榮小營[24]認(rèn)為雜交后的洗脫是提高信號檢出率的重要因素之一，因此應(yīng)選擇適宜的洗脫時(shí)間。（2）出現(xiàn)1個(gè)雜交信號可能的原因：一是DNA變性不太成功，導(dǎo)致探針無法順利與靶序列結(jié)合；二是洗脫時(shí)間可能過長，把與靶序列結(jié)合的探針洗脫下來，造成信號點(diǎn)少甚至沒有信號點(diǎn)的現(xiàn)象；三是有細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)碎片的存在，使探針與靶序列雜交相當(dāng)困難，同時(shí)熒光信號一般為小圓點(diǎn)，非常容易猝滅，因此要及時(shí)捕捉雜交信號也是不容易的[25]，因此制備出背景較干凈的葉片細(xì)胞染色體標(biāo)本至關(guān)重要。為了提高有效的雜交信號的檢出率，根據(jù)前期試驗(yàn)所出現(xiàn)的問題，對雜交條件做了部分調(diào)整，挑選了更為優(yōu)質(zhì)的標(biāo)本，延長了標(biāo)本變性的時(shí)間，選擇了更為適合的洗脫時(shí)間。通過這些調(diào)整，有效地提高了雜交信號的檢出率，達(dá)到了較為理想的效果。

研究表明，橡膠樹膠乳轉(zhuǎn)化酶活性和橡膠樹膠乳產(chǎn)量有很大的相關(guān)性，是影響膠乳代謝和再生的關(guān)鍵酶之一[10]，因此膠乳轉(zhuǎn)化酶基因在橡膠樹乳管蔗糖代謝和膠乳再生調(diào)控中具有舉足輕重的地位。本研究利用FISH技術(shù)將HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3分別定位于巴西橡膠樹熱研7-33-97的第5號、第2號和第3號3條不同的染色體上。研究結(jié)果表明，這3個(gè)基因互為獨(dú)立基因，其中HbNIN1基因與高和瓊[26]定位的死皮病基因HbMyb1都位于5號染色體的長臂上，兩者為連鎖基因且兩者之間的距離為17.89；HbNIN3基因與邱海燕[19]定位的REF基因也是連鎖基因，但前者位于熱研7-33-97第3號染色體短臂上，后者位于長臂上；而HbNIN2基因目前并未找到與之連鎖的基因。通過對HbNIN基因家族進(jìn)行物理定位有助于進(jìn)一步了解該家族基因的位置關(guān)系、分布特點(diǎn)，及與其他基因的關(guān)系，確定現(xiàn)有的橡膠遺傳圖譜的準(zhǔn)確性及完整性，為染色體微切割，建立含轉(zhuǎn)化酶基因的特定染色體片段的基因文庫，進(jìn)而分離和利用這些基因提供某些依據(jù)，同時(shí)還可以為橡膠樹遺傳育種、基因工程以及比較基因組學(xué)研究提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

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