宿文輝 孟曉娜 賈曉宇

摘 要：探討Rah13 GTPase對血睪屏障（blood testis barrier， BTB）通透性的調(diào)節(jié)機(jī)制。體外分離培養(yǎng)20d齡大鼠睪丸支持細(xì)胞，睪酮處理后測定跨上皮電阻（transepiihelial electrical resistance，TER）， FITC-鬼筆環(huán)肽染色分析F-actin分布，并采用Western印跡檢測Rad13在睪酮處理前后的表達(dá)變化；siRNA干擾培養(yǎng)支持細(xì)胞中Rab13的表達(dá)。Western印跡檢測沉默效果并檢測連接蛋白表達(dá)變化；TER測定Rab13沉默前后上皮屏障功能改變，F(xiàn)-actin染色分析Rah13沉默對肌動蛋白絲分布的影響。結(jié)果顯示，睪酮處理可使體外支持細(xì)胞屏障TER值升高.F-actin在膜下聚集增強(qiáng)，且Rab13在睪酮處理后表達(dá)量明顯降低；Rab13 siRNA處理不影響連接蛋白質(zhì)的表達(dá)，但可引起F-actin在細(xì)胞連接處的分布增強(qiáng)，導(dǎo)致體外BTB屏障功能增強(qiáng)。表明Rab13可通過調(diào)節(jié)F-actin的排布影響體外BTB通透性。

關(guān)鍵詞：血睪屏障：支持細(xì)胞：Rabl3：肌動蛋白絲

中圖分類號：R339.2+I

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）06-0500-05

血睪屏障（blood-testis barrier， BTB）是睪丸中血管和曲細(xì)精管之間的物理屏障，是由曲細(xì)精管支持細(xì)胞（Sertoli cell）、血管內(nèi)皮基膜、結(jié)締組織和曲細(xì)精管基膜組成的屏障結(jié)構(gòu)。其中，支持細(xì)胞間的各種細(xì)胞連接，如緊密連接、縫隙連接和特化的黏著連接等，是構(gòu)成BTB的主要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，創(chuàng)造了相對穩(wěn)定的生精內(nèi)環(huán)境，既為精原細(xì)胞的發(fā)育提供營養(yǎng)，又阻止細(xì)胞毒性物質(zhì)進(jìn)入管腔，防止精子與免疫系統(tǒng)接觸。構(gòu)成BTB的各種細(xì)胞連接具有特征性的微絲束分布，這些肌動蛋白絲（F-actin）垂直于生精上皮內(nèi)兩相鄰的支持細(xì)胞膜，使BTB的細(xì)胞連接較其他各種生理屏障具有更強(qiáng)的粘附力。

在生精細(xì)胞穿越生精上皮的過程及精子釋放入生精小管腔過程中，緊密連接復(fù)合體必須不斷地解聚和重新紺裝，這就需要相關(guān)的連接蛋白快速地在細(xì)胞膜進(jìn)行內(nèi)吞和再循環(huán)。Rab GTPase是一族相對分子質(zhì)量為20～30 kD的GTP結(jié)合蛋白，屬于Ras超家族。Rab GTPase主要參與細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞器間的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)的循環(huán)利用、內(nèi)吞、胞吐等過程。我們在前期研究中已經(jīng)驗證了 Rab13在大鼠睪丸紺織中的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Rab13的表達(dá)是隨著生精上皮周期的變化而變化；本研究利用體外BTB模型，即原代培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞，進(jìn)一步驗證Rab13在調(diào)節(jié)血睪屏障通透性過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

20 d雄性SD大鼠（40～50 g）山中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。兔抗Rab13抗體購自Abcam公司（英國）；兔抗Occludin、兔抗ZO-l、小鼠抗β-catenin購自 Invitrogen（美國）：兔抗N-cadherin、山羊抗actin抗體、?？雇谩⑴？股窖騦gG均購自Santa Cruz公司（美國）：FITC-鬼筆環(huán)肽、DMEM培養(yǎng)基為Sigma公司（美國）產(chǎn)品；靶向干擾Rab13的小RNA及對照組小RNA購自GenePharma（中國）；ReboJuice轉(zhuǎn)染試劑購自Novasgen公司（美國）；Prolong Gold Antifade封片齊0pti-MEM購自In-vitrogen公司（美國）；ECL顯色試劑盒購自Tnermo公司（美國）；PVDF膜為Millipore公司（美國）產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為Sigma公司（美國）產(chǎn)品。

1.2 主要儀器設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)板和transwell培養(yǎng)板為CorningCostar公司（美國）產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡為Olvmpus公司（日本）產(chǎn)品；臺式低溫超速離心機(jī)購自Sigma公司（美國）；數(shù)字電阻儀購自上海加佳電子儀表廠（中國）；電泳儀、電泳槽均購自Bio-Rad公司（瑞典）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠支持細(xì)胞原代培養(yǎng)

按本實驗室常規(guī)方法分離培養(yǎng)大鼠支持細(xì)，胞。取出生20 d雄性SD大鼠睪丸，去被膜，在DMRM培養(yǎng)基中剪碎至1 mm3用胰蛋白酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶依次在37℃進(jìn)行消化，消化產(chǎn)物經(jīng)多次低速離心（<700 g）后接種于涂有 Matrigel的培養(yǎng)平板（0.5×10 6/cm2）、雙室模型（1.2×10 6/cm2）或蓋玻片（置于培養(yǎng)板中，0.05xlO 6/cm2）中，于35℃、5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日更換無血清DMEM培養(yǎng)液（含表皮生長因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素及桿菌肽等營養(yǎng)因子）。培養(yǎng)48 h后，用20 mmol/LTris （pH 7.4）對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行低滲處理以上除混雜的生精細(xì)胞。該方法分離培養(yǎng)的睪丸支持細(xì)胞純度可達(dá)98%，極少有各級生精細(xì)胞、肌樣細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的污染。

1.3.2 跨上皮電阻（TER）測定

在雙室培養(yǎng)皿上層接種的支持細(xì)胞，于培養(yǎng)1～7 d每日用數(shù)字電阻儀（DT-9208，上海）測量并記錄TER值，以反映上皮細(xì)胞間緊密連接的功能。

1.3.3 睪酮處理培養(yǎng)細(xì)胞

為檢測Rab13在睪酮增強(qiáng)支持細(xì)胞上皮功能過程中的作用，于培養(yǎng)第4 d用睪酮（0.2 moI/L）處理支持細(xì)胞，每日測定TER值，并于處理后不同時間點檢測睪酬處理組Rab13的表達(dá)量及F-actin的分布。

1.3.4 F-actin染色

培養(yǎng)第6d，4%多聚甲醛于室溫固定接種于蓋玻片上的支持細(xì)胞10 min， O.l% Triton X-100通透處理4 min，隨后用含F(xiàn)ITC-鬼筆環(huán)肽（l：150）的l%BSA避光室溫孵育1 h，Prolong gold antifade封片劑（含DAPI）封片.Olympus BX60熒光顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。

1.3.5 免疫印跡

NP-40裂解液（50 mmol/L Tris、150 mmol/LNaCl、2 mmol/L EGTA、lO% glycerol、l%， NonidetP-40、pH 8.0）處理睪丸或體外培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞，提取總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度后制備蛋白樣品。不同處理組蛋白（30 μg）經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，依次經(jīng)一抗、二抗孵育后進(jìn)行ECL顯影，Scion Image軟件掃描。β-actin做為蛋白內(nèi)參照。

1.3.6 siRNA轉(zhuǎn)染

由上海GenePhama公司合成大鼠Rab13 siR-NAs，預(yù)實驗確定干擾效果。所用序列如下：Rab13 siRNA，5-CAUCJUAAGUGCUCUUGAAGtt-3，5'-CUUCAACAGCACUUACACCtt-3'；對照組sjRNA，5 -AGGAGAUGJUGAUAUUGGCUtt-3 ，5 -AGCCAAUAUCACAUCUCCUtt-3。BLAST排除與其他基因序列的同源性。于培養(yǎng)第4d進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染：在Opti-MEM中混勻siRNA及Re-boJuice轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)預(yù)實驗及培養(yǎng)密度確定siRNA濃度（TER測定實驗150 nmol/L， Western及細(xì)胞染色100 nmol/L）：轉(zhuǎn)染24 h后更換正常無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中所涉及TER及Western印跡等實驗結(jié)果采用GB-STAT分析軟件（版本7.0； Dy-namlc microsystems）進(jìn)行雙因素方差分析及Dun-nett's檢驗，P<0.05為差異顯著，P

2 結(jié)果

2.1 Rab13參與睪酮對體外BTB屏障功能的調(diào)節(jié)

體外分離大鼠支持細(xì)胞，于雙室培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，建立體外BTB模型，培養(yǎng)l～7 d測定跨上皮電阻（TER），結(jié)果顯示在培養(yǎng)第4 d TER值達(dá)到最高（圖1A）。于培養(yǎng)第4d用睪酮（0.2 mol/L）處理，TER測定顯示睪酮可以顯著提高支持細(xì)胞屏障功能（圖1A）； F-actin染色顯示，睪酮處理組肌動蛋白絲在細(xì)胞皮質(zhì)處的分布增強(qiáng)（圖1 B）； Western印跡檢測睪酮組Rab13的表達(dá)在處理后12～48 h與對照組相比明顯下降（圖IC、D），提示睪酮可能通過調(diào)節(jié)Rahl3的表達(dá)影響支持細(xì)胞上皮通透性，即Rabl3參與調(diào)節(jié)體外BTB屏障功能。

2.2 體外siRNA干擾支持細(xì)胞Rab13的表達(dá)

為確定睪酬處理后支持細(xì)胞上皮通透性變化與Rab13表達(dá)量變化之間的關(guān)系.于培養(yǎng)第4 d在Sertoli細(xì)胞中通過siRNA干擾Rab13的表達(dá)24 h。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，Western印跡顯示Rab13表達(dá)量經(jīng)干擾后與對照組相比可降低至70%，且對上皮屏障功能相關(guān)的緊密連接蛋白 （occludin、ZO一1）及粘附連接蛋白（N -cadherin、β-Catenin）的表達(dá)無靶外效應(yīng).即Rab13沉默并未引起連接蛋白的表達(dá)量變化。

2.3 Rab13 siRNA通過影響F-actin分布調(diào)節(jié)支持細(xì)胞屏障功能

siRNA干擾沉默支持細(xì)胞Rab13表達(dá)后，TER測定結(jié)果顯示Rab13 siRNA處理組細(xì)胞的屏障功能明顯高于對照siRNA處理組（圖3A）；F—actin染色亦發(fā)現(xiàn)Rab13沉默可引起與睪酮處理后相類似的改變，即F-actin在支持細(xì)胞膜下的聚集（圖3B）。這些結(jié)果表明，Rab13可通過影響F-actin在支持細(xì)胞中的排布影響體外BTB上皮的通透性。

3 討論

精子發(fā)生過程依賴于穩(wěn)定的生精內(nèi)環(huán)境，BTB使循環(huán)系統(tǒng)中的有害物質(zhì)被支持細(xì)胞的連接復(fù)合體阻擋而不能進(jìn)入生精上皮內(nèi)的近腔小室.保證了其中精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子變態(tài)在穩(wěn)定的微環(huán)境進(jìn)行。BTB中，支持細(xì)胞緊密連接處的細(xì)胞膜與膜下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池之間有大量平行排列的微絲束，這些微絲束與生精上皮周期中連接復(fù)合體組成蛋白的組裝和解聚密切相關(guān)。肌動蛋白結(jié)合蛋白（aCtin-binding protein，ABP），如Eps8 、Arp3、drebrin E、filamin A等，可以通過調(diào)節(jié)F-actin在支持細(xì)胞中的分布影響B(tài)TB中連接復(fù)合體的組裝，進(jìn)而影響血睪屏障周期進(jìn)程及精子發(fā)生過程。

在研究上皮細(xì)胞的緊密連接組裝的過程中，人們發(fā)現(xiàn)了多種Rab GTPase在連接復(fù)合體中的定位，并發(fā)現(xiàn)有多種Rab GTPase參與調(diào)節(jié)緊密連接的動力學(xué)變化。例如：Rab3B在PC12細(xì)胞中的過表達(dá)可以引起ZO-l的定位變化和肌動蛋白絲的重新組織，Rabl0在MDCK細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮作用。目前，對睪丸中Rab GTPase的研究還很少，其中，Rab8B被證明在睪丸支持細(xì)胞中可以與E-cadherin以及γ-catenin等連接復(fù)合體分子發(fā)生免疫共沉，Rab4A也被證明通過與catenin相互作用參與支持細(xì)胞與生精細(xì)胞間粘附連接的解聚過程。在前期研究中，我們檢測了Rab13在大鼠睪丸中的表達(dá)分布，發(fā)現(xiàn)Rab13在生精小管內(nèi)的分布隨生精上皮周期的變化而變化，為進(jìn)一步闡明Rab13在生精上皮屏障中的作用，我們在本研究中采用體外分離培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞，建立體外BTB研究模型。在該模型培養(yǎng)條件下，TER測定顯示支持細(xì)胞間建立了功能性的緊密連接屏障，電鏡下具有緊密連接、縫隙連接、橋粒、基底特化的粘著連接等體內(nèi)BTB的特征性結(jié)構(gòu)，即可以模擬體內(nèi)BTB進(jìn)行功能性研究。

由于已知睪酮可以加強(qiáng)支持細(xì)胞BTB的屏障功能，我們存本研究中用睪酮處理培養(yǎng)的支持細(xì)胞，建立緊密連接屏障增強(qiáng)的體外BTB模型與以往研究結(jié)果一致，TFR測定結(jié)果顯示睪酮處理可顯著提高體外BTB的完整性，且F-actin染色亦顯示睪酮處理后F-actin在細(xì)胞膜下分布增多；進(jìn)一步免疫印跡檢測Rab13的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在睪酮處理支持細(xì)胞12 h后，Rab13的蛋白水平開始下降，提示Rab13可能參與BTB的完整性調(diào)節(jié)。

為明確Rab13對BTB功能的影響，我們采用siRNA 干擾沉默培養(yǎng)支持細(xì)胞中Rab13的表達(dá)，結(jié)果顯示Rab13的蛋白表達(dá)水平可沉默至對照組的30%左右.此時緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-l及粘著連接蛋白N-cadherin、β-Catenin的蛋白水平均未發(fā)生明顯改變，即Rab13沉默對連接蛋白的表達(dá)量無影響。而TER測定顯示Rab13siRNA處理24 h后，體外BTB的屏障功能顯著提高；進(jìn)一步F-actin染色，結(jié)果顯示Rab13表達(dá)受到干擾后，F(xiàn)-actin與睪酮處理后相類似，即在細(xì)胞皮質(zhì)處的分布顯著增強(qiáng)。以上結(jié)果說明，Rab13 可通過調(diào)節(jié)F-actin在細(xì)胞連接處的排布，而不是連接蛋白質(zhì)的表達(dá)，來影響睪丸支持細(xì)胞屏障的通透性，而這種影響亦參與睪酮對BTB完整性的調(diào)控過程中。研究表明，睪酮可以通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞膜連接蛋白的循環(huán)利用，并且通過影響肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白的功能，加強(qiáng)細(xì)胞連接處的肌動蛋白絲的分布并增強(qiáng)BTB完整性。在本研究中，支持細(xì)胞經(jīng)睪酮處理后，F(xiàn)-actin在膜下聚集強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Rab13被沉默后F-actin在膜下聚集強(qiáng)度.說明Rab13不是睪酮起作用的唯一途徑.而Rab13與其他參與睪酮作用的因素之間是否存在相互作用，還需進(jìn)一步研究確定。