唐曉麗

【摘 要】呼吸道感染是兒科最常見的疾病，病毒是引起呼吸道感染最常見的病原 [1]。常見的呼吸道病毒有呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒和腺病毒等。近年來新的致病性病毒也不斷地被發(fā)現(xiàn)，如人類偏肺病毒、人博卡病毒、SARS病毒、高致病性禽流感病毒等。部分病毒傳染性強，傳播速度快，潛伏期短，臨床表現(xiàn)類似，兒科醫(yī)生無法依據(jù)病情準確判斷病原，給臨床診斷及治療帶來極大困難。精確的病原學(xué)分析不僅是臨床確診依據(jù)，也對控制傳播途徑、采取預(yù)防措施及合理選擇治療方案非常重要。因此，臨床開展準確、快速呼吸道病毒檢測已成為兒童呼吸道感染中的重要診斷手段，而基于PCR技術(shù)的分子診斷方法就成為呼吸道病毒檢測的新標準。

【關(guān)鍵詞】呼吸道病毒；病毒檢測；分子診斷方法

呼吸道病毒感染傳統(tǒng)的診斷方法為病毒分離培養(yǎng)及血清學(xué)實驗。病毒分離培養(yǎng)是確診病毒及發(fā)現(xiàn)新病毒的重要技術(shù)手段，但培養(yǎng)及鑒定過程繁瑣，費時，診斷效率低，臨床開展有一定困難。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基于PCR技術(shù)的分子診斷方法已成為呼吸道病毒檢測的新標準。本文就目前呼吸道病毒核酸檢測的研究進展作一總結(jié)論述。

1 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)可在一次反應(yīng)體系中同時檢測和鑒別多種病原體，在混合感染的鑒別診斷上具有很高的實用價值。因其快速、簡便和高通量等特點，目前多重PCR技術(shù)在呼吸道病毒的檢測中已得到了廣泛應(yīng)用。近年出現(xiàn)了一些自動化程度高，操作簡單的檢測平臺，如Seeplex TMRV和Labopass TMRV檢測試劑盒。Seeplex TMRV試劑盒在保證高度特異性的同時，具有更大范圍的退火適宜溫度，Seeplex TMRV-12試劑盒則能夠同時檢測12種呼吸道病毒。

2 多重實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號的積累，對常規(guī)PCR過程進行可視化的實時監(jiān)測。近年來多重熒光定量PCR技術(shù)已成為呼吸道病毒檢測的研究熱點。該方法具有特異性強、重復(fù)性好、實時定量等特點，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。運用多重熒光定量PCR方法可成功地對流感病毒進行分型，也可同時檢測副流感病毒、冠狀病毒和呼吸道合胞病毒等多種呼吸道病毒。Sung等應(yīng)用多重熒光定量PCR方法檢測急性呼吸道感染住院患兒呼吸道標本中的病毒，總陽性率為47%，是病毒培養(yǎng)等常規(guī)方法檢出率的2倍。Chen[2]等用該方法檢測流感病毒和呼吸道合胞病毒，發(fā)現(xiàn)其檢測靈敏度和特異度分別為99%和100%。但PCR方法不能區(qū)別有毒力的病毒和死病毒，因此目前尚不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)。

3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAmP）

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)是利用6條特異性引物與靶基因的6個不同區(qū)域進行退火雜交和等溫擴增。該方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)及紫外線觀察等過程，因此具有簡單、快速等特點。利用LAMP技術(shù)，還可對甲型流感H1到H3亞型進行分型。因該技術(shù)對實驗室條件要求不高，故特別適合基層單位進行病原微生物的快速檢測。

4 依賴核酸序列的擴增技術(shù)（NASBA）

依賴核酸序列的擴增技術(shù)是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，是由一對帶有T7啟動子序列的引物引導(dǎo)的連續(xù)、等溫的核酸擴增技術(shù)?？稍?h內(nèi)將模板RNA擴增109倍，比常規(guī)PCR高1000倍，因此具有快速、靈敏、特異性強等特點。

5 基因芯片

基因芯片又稱基因微陣列，是指將大量靶基因片段固定在經(jīng)過修飾的載體上，與標記的核酸樣品進行雜交，經(jīng)信號處理系統(tǒng)分析雜交信號，獲取樣品檢測結(jié)果?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、快速檢測等特點，已被廣泛應(yīng)用于多種病毒的檢測。利用基因芯片技術(shù)，可通過一次檢測獲取所有病毒信息，包括發(fā)現(xiàn)新病毒或變異株。丁麗新[3]等采用基因芯片對180例發(fā)病初期的呼吸道感染病人的咽拭子標本進行檢測，其結(jié)果表明采用基因芯片技術(shù)可以在短時間內(nèi)直接從病人的咽拭子標本中同時檢測8種呼吸道病原體。Chiu等建立的病毒芯片可同時檢測7種呼吸道病毒，檢出效率較免疫熒光法提高了19%，與特異性PCR擴增檢測方法相當。但基因芯片的不足之處在于費用高，研制周期長，在臨床廣泛應(yīng)用有一定困難。

6 深度測序技術(shù)

2005年底，454公司推出了基于焦磷酸測序法的高通量基因組測序系統(tǒng)。與傳統(tǒng)測序相比，該方法的主要特點是能在極短時間內(nèi)對生物樣品基因組進行分析，可在未知基因組信息的情況下用于直接病毒檢測，有助于檢測未知病毒和病毒突變株。Yongfeng H[ 4 ]等采用該技術(shù)對4位病人咽拭子標本進行檢測，在48小時內(nèi)獲得了超過590000個序列，涵蓋了幾乎全部細菌、真菌、病毒等核酸信息，此外，甲型流感病毒被特異性檢出。但測序檢測到的病毒序列不足以建立疾病的因果關(guān)系，因此在臨床應(yīng)用中還需結(jié)合病毒培養(yǎng)及血清學(xué)方法共同分析。

7 自動化檢測系統(tǒng)

隨著分子診斷方法的日益完善，呼吸道病毒的商品化檢測技術(shù)平臺相繼問世。FDA于2008年批準可同時檢測和鑒定l2種特殊呼吸道病毒的xTAG呼吸道病毒檢測板在美國上市。xTAG可同時檢測和區(qū)別A型流感病毒H1和H3亞型，也可檢測2001年才被人類認識和發(fā)現(xiàn)的人類偏肺病毒。該試劑盒在2009年流感大流行期間發(fā)揮了重要的監(jiān)測作用。目前最新的xTAG試劑盒可在3.5h內(nèi)同時檢測多達20種病毒及其亞型。ProFlu+是另一種FDA批準的病毒即時檢測法，該方法可在3h內(nèi)完成4種常見呼吸道病毒（A型和B型流感病毒及A型和B型呼吸道合胞病毒）的檢測。

BD Max系統(tǒng)是美國BD公司研發(fā)的全自動實時定量PCR檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了全自動核酸提取和實時熒光定量PCR技術(shù)，擴增反應(yīng)在3h內(nèi)完成。研究顯示該技術(shù)對流感病毒和RSV的檢測靈敏度和特異度均達到較高水平。Idaho Technologies公司研發(fā)的FilmArray分子診斷平臺能在1小時內(nèi)完成從核酸提取到數(shù)據(jù)分析過程，目前該平臺能檢測15種常見的呼吸道病毒[5]。

這些自動化的操作系統(tǒng)與傳統(tǒng)檢測方法相比，能明顯縮短檢測時間，實現(xiàn)高通量檢測，同時避免了實驗操作中的人為因素誤差，使得檢測結(jié)果更加均一，是今后病毒檢測技術(shù)的發(fā)展方向所在。

8 小結(jié)

呼吸道病毒是呼吸道感染的主要病原，多種病毒的協(xié)同感染、病毒的變異和新病毒的出現(xiàn)給人們認識和防控病毒感染帶來巨大挑戰(zhàn)。在臨床工作中，對呼吸道感染病人進行病毒病原的檢測能為疾病的臨床診斷和治療提供可靠的病原學(xué)依據(jù)，防止抗菌藥物濫用。此外，長期監(jiān)測特定地區(qū)病毒的流行季節(jié)、易感人群及臨床表現(xiàn)對疾病的預(yù)防、流行病學(xué)研究及疫苗的研制均有重要意義。因此了解和掌握呼吸道病毒檢測新技術(shù)、新方法對疾病的診斷、治療和疫情的防控非常重要。由于核酸檢測方法的靈敏度、特異性都較傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、免疫熒光等方法顯著提高，目前已成為各實驗室主要檢測技術(shù)。有研究顯示，多重PCR檢測呼吸道病毒是最節(jié)約成本的檢測手段，實時熒光定量PCR技術(shù)能提供病毒載量的定量信息，有助于進一步研究病毒與臨床表現(xiàn)關(guān)系，高通量的檢測方法及宏基因組技術(shù)是目前的發(fā)展趨勢，而新型核酸擴增技術(shù)如NASBA也有很好的發(fā)展前景。近年來，分子診斷技術(shù)自動化程度不斷提高，商品化的自動檢測技術(shù)大大提高了實驗效率，使其更加符合臨床需要。在臨床工作中，我們可根據(jù)自身實驗?zāi)康募皩嶒灄l件選擇檢測技術(shù)，為呼吸道感染的病毒病原學(xué)診斷提供可靠依據(jù)。

參考文獻

[1]Mathony J B.Detection of respiratory viruses by molecular methpds[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（4）：716-747.

[2]Chen Y，Perez J W，Vargis e A，et al .Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immune-polymerase chain reaction[J]. Anal Biochem，2011，26（2）：124-126.

[3]丁麗新，吳疆，林長纓.基因芯片技術(shù)在常見呼吸道病毒感染早期診斷上的應(yīng)用[J].國際病毒學(xué)雜志，2007，14（4）：105-107.

[4]Yongfeng H， Fan Y， Jie D， et al. Direct pathogen detection from swab samples using a new high throughput sequencing technology[J]. Clin Microbiol Infect，2011，17（2）：241-244.

[5]Poritz M A，Blaschke A J，Byington C L，et al.FilmArray，an automated nested multiplex PCR system for multi-pathogen detection：development and application to respiratory tract infection[J]. Plos One，2011，6（10）：e26047.