利用SSR分子標(biāo)記快速鑒別中粒種與小粒種咖啡

王曉陽(yáng)等

摘 要 為快速、準(zhǔn)確地鑒別中粒種與小粒種咖啡，以不同種源的中粒種和小粒種咖啡為試驗(yàn)材料，對(duì)514對(duì)SSR引物進(jìn)行中、小粒種咖啡種間特異性引物篩選，最終篩選到1對(duì)特異性引物，該引物在小粒種咖啡樣本中擴(kuò)增出90 bp和110 bp雙帶產(chǎn)物，而在中粒種咖啡樣本中只擴(kuò)增出90 bp或100 bp的單帶產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物條帶的數(shù)目即可對(duì)中粒種和小粒種咖啡進(jìn)行鑒別。經(jīng)隨機(jī)抽取中、小粒種咖啡樣本進(jìn)行種類鑒別準(zhǔn)確性驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與實(shí)際結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞 中粒種咖啡；小粒種咖啡；SSR；鑒別

中圖分類號(hào) S571.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Distinguishing Analysis Between Coffea canephora and

C. arabica Species by SSR Markers

WANG Xiaoyang1， DONG Yunping1 *， HUANG Lifang1， YAN Lin1

ZHOU Hua2， CHEN Jinhuan3， SUN Yan1， LIN Xingjun1

1 Spice and Beverage Research Institute， CATAS / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，

Ministry of Agriculture / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice

and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

2 Dehong Tropical Agriculture Institute of Yunnan， Ruili， Yunnan 678600， China

3 Tropical and Subtropical Economic Crops Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Baoshan，

Yunnan 678025， China

Abstract This study was conducted to provide an efficient method to distinguish between C. canephora and C. arabica. One pair of coffee species-specific SSR primers were selected from 514 pairs of SSR primers. The results of PCR amplifying analysis demonstrated that two fragments of 90 and 110 bp from C. arabica and one fragment of 90 or 100 bp from C. canephora were respectively amplified by the primers， meaning C. arabica and C. Canephora coffee could be identified according to the number of amplified fragments. The result of the method was proved to be reliable through our verification test.

Key words Coffea canephora； Coffea arabica； SSR； Distinguishing

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.002

咖啡為世界三大飲料之首，是國(guó)際貿(mào)易中非常重要的原料產(chǎn)品[1-2]?？Х葹檐绮菘疲≧ubiaceae）咖啡屬（Coffea）植物，該屬植物共100多種，而生產(chǎn)性栽培的主要為小粒種和中粒種，小粒種約占栽培面積的70%，中粒種約占30%[3-5]。小粒種咖啡因其品質(zhì)優(yōu)于中粒種咖啡，其國(guó)際市場(chǎng)交易價(jià)格也經(jīng)常是中粒種咖啡的2～3倍，因此，在咖啡貿(mào)易過(guò)程中常常出現(xiàn)將中粒種咖啡冒充小粒種咖啡進(jìn)行銷售的不法行為，損害消費(fèi)者的利益[6]；另外，兩種咖啡適合種植的生長(zhǎng)環(huán)境也有差異，小粒種適合種植于高海拔溫?zé)岬貛?，而中粒種適合種植于低海拔的高溫濕熱地區(qū)，如果兩種咖啡的種子或苗木發(fā)生混淆，則會(huì)造成咖啡減產(chǎn)并影響咖啡品質(zhì)，給咖啡種植者帶來(lái)很大影響[7-8]。因此，生產(chǎn)和市場(chǎng)貿(mào)易上急需一種快速、方便、可靠的鑒別中、小粒種咖啡的檢測(cè)方法。

傳統(tǒng)方法鑒別中、小粒種咖啡主要通過(guò)將咖啡培炒后進(jìn)行杯品品嘗，這種方法容易受主觀人為因素及培炒條件等影響，鑒別結(jié)果不準(zhǔn)確，且需要專業(yè)杯品師參與，可操作性差?，F(xiàn)有中、小粒種咖啡鑒別技術(shù)主要包括化學(xué)分析法及DNA分子標(biāo)記檢測(cè)法?；瘜W(xué)分析法主要基于兩種咖啡內(nèi)含特定化學(xué)物質(zhì)含量存在差異，通過(guò)測(cè)定這些化學(xué)物質(zhì)含量，如固醇類、脂肪酸、綠原酸及咖啡因等，再與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較鑒別，由于這類化學(xué)物質(zhì)含量都處于一個(gè)幅度范圍，沒(méi)有固定值，且含量差異不是十分明顯，同時(shí)，某些化學(xué)物質(zhì)含量容易受栽培條件、代謝生理等因素的影響，檢測(cè)結(jié)果精確性較差[9-11]。

基于檢測(cè)DNA分子水平多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為種間鑒別提供了有效途徑，DNA分子標(biāo)記可以直接反映DNA水平上的遺傳多態(tài)性，表現(xiàn)為核苷酸序列上的差異，這種方法不受人為及環(huán)境因素的影響，檢測(cè)結(jié)果非常精確。在所有分子標(biāo)記中，SSR分子標(biāo)記由于具有染色體上分布均勻、多態(tài)性豐富、共顯性、分辨率高和易于檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，自開(kāi)發(fā)以來(lái)就成為最為有效構(gòu)建許多作物指紋圖譜的工具，被廣泛應(yīng)用于品種鑒定等方面[12-14]。目前尚未有利用SSR 分子標(biāo)記鑒別咖啡種類的方法，因此，本研究擬開(kāi)發(fā)出一種利用SSR分子標(biāo)記快速鑒別中粒種與小粒種咖啡的方法，為咖啡生產(chǎn)上種子、苗木種類鑒定及咖啡市場(chǎng)貿(mào)易中產(chǎn)品的真?zhèn)舞b別提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為中粒種和小粒種咖啡不同種質(zhì)葉片，分別取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（以下簡(jiǎn)稱“香飲所”）、云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所（以下簡(jiǎn)稱“德熱所”）和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所（以下簡(jiǎn)稱“熱經(jīng)所”）咖啡種質(zhì)資源圃。材料分兩部分，一部分用于篩選中粒種、小粒種咖啡種間特異性SSR引物（表1），另一部分用于驗(yàn)證所篩選引物在中粒種與小粒種之間的種間特異性。取上述種質(zhì)樣本的新鮮無(wú)病斑嫩葉，置于-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆没蚶霉枘z干燥劑干樣保存。

1.2 方法

2 結(jié)果與分析

2.1 引物初篩

特異性引物篩選所用引物來(lái)源于文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)表、公布的咖啡種屬特異性SSR引物[15-24]，共514對(duì)。利用中、小粒種咖啡樣本各2個(gè)（中粒種：越南、泰國(guó)；小粒種：卡蒂姆7963、鐵畢卡）進(jìn)行篩選，剔除無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或無(wú)多態(tài)性引物，選留擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、種內(nèi)一致性較高、種間差別明顯的引物作為候選引物，初步篩選出種間特異性候選引物10對(duì)（圖1）。

2.2 引物復(fù)篩

利用中、小粒種咖啡樣本各20個(gè)，對(duì)初步篩選出的10對(duì)SSR引物進(jìn)行復(fù)篩，最終篩選出中、小粒種咖啡種間特異性SSR引物1對(duì)，引物名稱為：SSR124195，引物序列為：Forward primer（5′-3′）：ATCCCCATCAGAAGACCTCA；Reverse primer（5′-3′）：CCTCCACCGCCTGTTTATTA。該引物在小粒種咖啡樣本中擴(kuò)增出90 bp和110 bp雙帶產(chǎn)物，而在中粒種咖啡樣本中只擴(kuò)增出90 bp或100 bp的單帶產(chǎn)物（圖2），因此，根據(jù)產(chǎn)物條帶的數(shù)目即可對(duì)中粒種和小粒種咖啡進(jìn)行鑒別，即雙帶為小粒種咖啡，單帶為中粒種咖啡。中、小粒種咖啡樣本及SSR124195對(duì)樣本的擴(kuò)增情況見(jiàn)表2。

2.3 種屬鑒別驗(yàn)證

田間隨機(jī)抽取中、小粒種咖啡樣本各23份，利用SSR124195引物進(jìn)行種屬鑒別，結(jié)果顯示，中粒種樣本擴(kuò)增條帶全部為90 bp或100 bp的單帶產(chǎn)物（圖3），小粒種全部為90 bp和110 bp的雙帶產(chǎn)物（圖4），驗(yàn)證結(jié)果與實(shí)際結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記技術(shù)因直接檢測(cè)DNA分子水平上的遺傳差異，不受人為及環(huán)境因素的影響，相比其他鑒別中、小粒種咖啡的方法，分子標(biāo)記在檢測(cè)精度上具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。Spaniolas[25]等利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)中、小粒種咖啡進(jìn)行了鑒別研究。該方法基于咖啡trnL-trnF基因中長(zhǎng)度為251 bp的一段序列，該序列包含一限制性酶切位點(diǎn)，能夠被限制性酶Psul酶切成92和159 bp兩個(gè)片段。小粒種在該酶切位點(diǎn)上存在1個(gè)SNP，因而不能被酶切，電泳檢測(cè)結(jié)果為251 bp一條條帶，而中粒種不存在該SNP，電泳檢測(cè)結(jié)果為92和195 bp兩條條帶，因此，根據(jù)酶切后電泳檢測(cè)結(jié)果能夠很好地區(qū)分中、小粒種咖啡，然而，該方法因檢測(cè)過(guò)程中需要使用限制性酶酶切，操作過(guò)程復(fù)雜且成本較高，在使用上受到較大限制。與前人的方法相比，本研究操作簡(jiǎn)便、快速，且重復(fù)性好、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有較好的應(yīng)用前景。

本研究篩選出的SSR124195引物為中粒種、小粒種咖啡的鑒別提供了一種有效途徑，如何保證鑒別效果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性是本研究最為關(guān)心的問(wèn)題，這就要求引物篩選所采用的樣本必須具有足夠的信息量和代表性。本研究采用的中、小粒種咖啡樣本均取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所、云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所和云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所三家國(guó)內(nèi)最主要的咖啡種質(zhì)資源保存單位，收集保存了國(guó)內(nèi)外大部分咖啡主栽品種及遺傳資源，樣本具有足夠的信息量和廣泛的代表性。本研究引物篩選及鑒別驗(yàn)證所用樣本既包括了當(dāng)前國(guó)內(nèi)外咖啡主栽品種，如小粒種的卡帝莫7963、卡杜拉、T5175、T8667、波邦、鐵畢卡，中粒種的6號(hào)、24號(hào)、26號(hào)、興28等，這增加了所篩選引物在咖啡商品貿(mào)易真?zhèn)渭胺N子、苗木種屬類別鑒別過(guò)程中的適用性；同時(shí)也包括了不同種源、不同性狀，遺傳差異顯著的種質(zhì)樣本，如來(lái)自巴西、哥倫比亞、危地馬拉、墨西哥、坦桑尼亞、厄瓜多爾、巴布亞新幾內(nèi)亞、哥斯達(dá)黎加、夏威夷、澳大利亞、肯尼亞等國(guó)家的不同種源及黃果、紫葉、矮種等性狀顯著差異的樣本，提高了所篩選引物的可靠性和穩(wěn)定性。

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