董慧雪 周燕蓉 田奇琳 賴恭梯 林玉玲 賴鐘雄

摘 要 以龍眼胚性愈傷組織為材料，研究不同繼代培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和光質(zhì)對(duì)龍眼胚性愈傷組織生長(zhǎng)和類黃酮含量的影響。參照前人的研究結(jié)果，龍眼胚性愈傷組織分別在含2，4-D和AgNO3的繼代培養(yǎng)基上交替繼代培養(yǎng)，測(cè)定其在黑暗條件下15、20、25、30、35 d的類黃酮含量，分析其含量變化；在此基礎(chǔ)上，分別于紅光、藍(lán)光、白光、黃光4種不同的光質(zhì)下培養(yǎng)愈傷組織，研究不同光質(zhì)對(duì)龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量積累的影響。研究結(jié)果表明：在黑暗條件下，龍眼胚性愈傷組織在含AgNO3培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d時(shí)類黃酮含量最高為1.857 0%；在不同光質(zhì)處理下，光質(zhì)影響類黃酮含量從高到低依次為：藍(lán)光（8.802 3%）>紅光（4.659 4%）>白光（4.272 4%）>黃光（2.816 9%）>黑暗（1.857 0%）。

關(guān)鍵詞 龍眼；胚性愈傷組織；光質(zhì)；類黃酮

中圖分類號(hào) S677.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）又名桂圓，屬于無(wú)患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus）。龍眼的果實(shí)既可鮮吃又可作為藥用，其果實(shí)味道甘甜，性溫順，還具有良好的滋養(yǎng)補(bǔ)益作用，可以有效改善因氣血不足、心脾虧損而引起的眩暈、健忘、失眠等癥狀[1-2]。福建屬于亞熱帶地區(qū)，適宜龍眼生長(zhǎng)，為世界上主要的龍眼主產(chǎn)區(qū)之一。類黃酮（Flavonoids）是許多食源性植物中重要的一類次生代謝產(chǎn)物，它主要以自由態(tài)（黃酮苷元）或結(jié)合態(tài)（黃酮苷）的形式存在于植物體內(nèi)。田景梅等[3-4]研究表明黃酮類成份不僅具有抗心血管疾病的作用還可以顯著抗氧化，并且在龍眼中的含量很高，可為研究心腦血管系統(tǒng)疾病提供幫助。

目前對(duì)龍眼類黃酮含量的研究所選用的材料主要集中在龍眼殼、龍眼核、龍眼葉和龍眼花上[5-8]，而對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的研究尚未見報(bào)道。近年來(lái)，生物制藥的發(fā)展趨向于利用細(xì)胞組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)植物次生物質(zhì)，對(duì)龍眼胚性愈傷組織進(jìn)行組織培養(yǎng)，能在短時(shí)間內(nèi)獲取大量材料[9]。在本實(shí)驗(yàn)室賴鐘雄[9]研究得到的兩種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)兩種不同的培養(yǎng)基上的龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量的對(duì)比，篩選出類黃酮含量最高的生長(zhǎng)時(shí)期；此外，植物的光合特性、品質(zhì)、生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝產(chǎn)物的形成還受到光質(zhì)的影響[10]，而且不同光質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)不同，不同波長(zhǎng)的光對(duì)同一種次生代謝產(chǎn)物的積累量影響不同[11]。因此在篩選出促進(jìn)龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量累積的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索龍眼胚性愈傷組織類黃酮積累的適宜光質(zhì)條件，研究結(jié)果為進(jìn)一步提高龍眼胚性愈傷組織內(nèi)類黃酮有效產(chǎn)量、優(yōu)化培養(yǎng)條件提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 龍眼胚性愈傷組織 由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供的龍眼‘紅核子胚性愈傷組織交替繼代于兩種不同的培養(yǎng)基上（培養(yǎng)基A： MS+20 g蔗糖+6 g瓊脂+1.0 mg/L 2，4-D，以下簡(jiǎn)稱2，4-D培養(yǎng)基；培養(yǎng)基B： MS+20 g蔗糖+6 g瓊脂+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+5 mg/L AgNO3，以下簡(jiǎn)稱AgNO3培養(yǎng)基）[9]。

1.1.2 試驗(yàn)儀器與試劑 753型分光光度計(jì)，電熱鼓風(fēng)烘干箱，恒溫水浴鍋（上海凱勒電子設(shè)備廠），電子分析天平（上海天平儀器廠），蘆?。ňS生素P）標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al（NO3）3、1 mol/L NaOH、無(wú)水乙醇等。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 每瓶接種4塊大小均勻的龍眼胚性愈傷組織，直徑2～4 mm，置于溫度（25±2）℃，黑暗條件下培養(yǎng)。分別在15、20、25、30和35 d時(shí)測(cè)定類黃酮含量，在篩選出類黃酮含量積累的最佳時(shí)期和最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行不同光質(zhì)處理并測(cè)定其類黃酮含量，即分別用藍(lán)光、紅光、白光、黃光每天光照 12 h，每個(gè)處理10瓶，3次重復(fù)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 120 ℃干燥恒重的蘆丁，準(zhǔn)確稱取5.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)60%微熱乙醇定容至50 mL，混合均勻得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。精密吸取其0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只試管中，分別加入體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇至5 mL，然后再各自加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min。加10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min。加1 moL/L NaOH溶液4 mL，加水0.4 mL，搖勻，放置10～15 min。每管不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液總體積都為10 mL，于510 nm處測(cè)定光譜吸收值α，3次重復(fù)，取平均值，以吸光值對(duì)濃度用最小二乘法得回歸方程、相關(guān)系數(shù)。

1.2.3 樣品提取 參考比較孔曉龍等[13-16]的類黃酮提取方法，本試驗(yàn)采用乙醇浸泡提取法提取類黃酮含量。將龍眼胚性愈傷組織從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)取出，用兩層濾紙包著放到電熱鼓風(fēng)烘干箱干燥烘干，并精確稱取龍眼胚性愈傷組織干燥恒重樣品0.5 g，秤取3份，分別用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇10 mL于水浴鍋75 ℃浸泡提取2次，每次浸泡提取2 h。過(guò)濾，待濾液冷卻后用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液定容至50 mL。

1.2.4 提取物含量的測(cè)定 分別吸取樣液5 mL 3份加入3支具塞試管中，各加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2的溶液0.3 mL，搖勻。加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min。加1 moL/L NaOH溶液4 mL， 加水0.4 mL， 搖勻， 放置5 min。 空白對(duì)照為體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇試劑，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光譜吸收比，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣液中類黃酮的含量。

1.2.5 類黃酮含量計(jì)算公式 光譜吸收比α=1.368 1C+0.008 2；樣品中的類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)=（ρV1/WV2）×10-1；式中ρ為樣液類黃酮的質(zhì)量濃度分?jǐn)?shù)；V1為抽提定容體積；V2為提取物含量測(cè)定取用樣液體積；W為稱樣質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel和SPSS19.0等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以濃度（C）為橫坐標(biāo)，光譜吸收比（α）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸繪圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，結(jié)果如圖1。

回歸方程為α=1.368 1C+0.008 2，其線性范圍為0～0.5 mg/mL，相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 4。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線符合試驗(yàn)要求，能較準(zhǔn)確的讀出相應(yīng)濃度。

2.2 2，4-D培養(yǎng)基和AgNO3培養(yǎng)基及不同時(shí)期對(duì)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的影響

不同繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)的龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化有明顯差異，如圖2所示。在AgNO3培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)過(guò)程中，在10到25 d時(shí)類黃酮的含量明顯上升，并在培養(yǎng)第25天達(dá)到峰值，類黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.857 0%；25～35 d類黃酮的含量開始逐漸下降。2，4-D培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織類黃酮含量雖然在15～20 d有所下降但整體呈上升趨勢(shì)。

總體比較，在35 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，2，4-D培養(yǎng)基培養(yǎng)下的類黃酮積累量始終沒(méi)有AgNO3培養(yǎng)基培養(yǎng)下的高。具體來(lái)說(shuō)，10～25 d類黃酮含量在兩種培養(yǎng)基上的差值越來(lái)越大，而在25～35 d的差值則越來(lái)越小。

2.3 不同光質(zhì)處理下龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的變化

在2.2的基礎(chǔ)上，利用AgNO3培養(yǎng)基結(jié)合不同光質(zhì)處理，25 d時(shí)龍眼胚性愈傷組織中的類黃酮含量如圖3所示。結(jié)果表明：4種光質(zhì)都有促進(jìn)類黃酮含量增加的作用，其中藍(lán)光最為明顯，其類黃酮含量為8.802 3%，紅光和白光處理下類黃酮含量相差并不明顯，分別為4.659 4%和4.272 4%；對(duì)照黑暗的含量最低。不同光質(zhì)下，龍眼胚性愈傷組織中類黃酮的含量的高低順序?yàn)椋核{(lán)光（8.802 3%）>紅光（4.659 4%）>白光（4.272 4%）>黃光（2.816 9%）>黑暗（1.857 0%）。

運(yùn)用SPSS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差在α=0.01水平上處理。結(jié)果表明材料在黑暗條件下培養(yǎng)時(shí)類黃酮的積累量和4種不同光質(zhì)處理下的類黃酮積累量有顯著性差異（p<0.05），其中，除了和黃光是差異顯著（0.01

3 討論與結(jié)論

3.1 AgNO3促進(jìn)龍眼胚性愈傷組織中類黃酮含量的積累

本試驗(yàn)首先在2，4-D培養(yǎng)基和AgNO3培養(yǎng)基上篩選出龍眼胚性愈傷組織類黃酮含量高的培養(yǎng)基，結(jié)果表明在AgNO3培養(yǎng)基上培養(yǎng)龍眼胚性愈傷組織，類黃酮含量在25 d達(dá)到峰值，而2，4-D培養(yǎng)基上的類黃酮含量在培養(yǎng)后期出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但最終沒(méi)有超過(guò)在含AgNO3培養(yǎng)基上類黃酮的含量。根據(jù)葉煒[16]的研究，AgNO3培養(yǎng)基促使類黃酮含量顯著上升的原因可能是因?yàn)锳gNO3能夠抑制乙烯的形成和其生理效應(yīng)以及維持胚性愈傷組織狀態(tài)，這一結(jié)果也與張真[17]的研究一致。而到25 d之后，可能是由于Ag+對(duì)胚性愈傷組織的持續(xù)脅迫作用，也可能是衰老引起的類黃酮含量下降，具體原因還有待于進(jìn)一步探討。而在含2，4-D培養(yǎng)基上的類黃酮含量在培養(yǎng)后期出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，這一現(xiàn)象與王文星[18]的研究一致，含2，4-D培養(yǎng)基有利于細(xì)胞黃酮的積累，由于工廠化要求在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)類黃酮，且后期培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)快消耗完，故沒(méi)有繼續(xù)培養(yǎng)的價(jià)值。

3.2 藍(lán)光處理最有利于龍眼胚性愈傷組織類黃酮的積累

研究表明光質(zhì)影響龍眼胚性愈傷組織中類黃酮的含量的積累。以黑暗培養(yǎng)為對(duì)照，愈傷組織中類黃酮含量的積累，在光照條件下有明顯的促進(jìn)作用，不同光質(zhì)對(duì)黃酮含量的積累能力大小依次為：藍(lán)光>紅光>白光>黃光>黑暗。在這4種光質(zhì)處理下，藍(lán)光最有利于龍眼胚性愈傷組織中類黃酮的積累，這與前人[19-21]在番茄、黃瓜中的研究是一致的。這可能是因?yàn)榧t光有利于可溶性糖和淀粉的積累，藍(lán)光有利于蛋白質(zhì)的合成，也就是植物自身的生長(zhǎng)有差異，進(jìn)而影響其體內(nèi)類黃酮的積累。光質(zhì)條件下的類黃酮的含量總是高于黑暗條件下的，謝寶東等[22]在光質(zhì)對(duì)銀杏葉片中黃酮含量影響的研究中也發(fā)現(xiàn)，光質(zhì)不同黃酮的含量也顯著不同，其中藍(lán)光最有利于黃酮的含量的積累，與上述結(jié)論相一致。但是蘇秀紅等[23]研究表明綠光處理下冬凌草體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的含量最大，紅光處理下含量最小。本試驗(yàn)沒(méi)有做綠光的處理，是本試驗(yàn)的不足之處，但仍然可以表明光質(zhì)會(huì)影響類黃酮的積累量，光是植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累的重要影響因子。

綜上所述，造成本試驗(yàn)結(jié)果的原因可能是：（1）光是植物生長(zhǎng)的重要因子，在植物生長(zhǎng)的過(guò)程中是一種重要的觸發(fā)信號(hào)，因此其可以影響植物體中物質(zhì)成分的積累[24]； （2）不同光質(zhì)的峰值、輻照[25]以及波長(zhǎng)不同，導(dǎo)致結(jié)果有所差異。本試驗(yàn)還存在一些局限性，比如試驗(yàn)設(shè)計(jì)得不全面，缺少綠光處理、用不同的光質(zhì)交替照射等。本試驗(yàn)得出的結(jié)論可以為進(jìn)一步研究光質(zhì)對(duì)龍眼胚性愈傷組織中的次生代謝產(chǎn)物的積累提供科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)之后，可以結(jié)合分子手段，研究具體的基因與類黃酮表達(dá)的關(guān)系。

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責(zé)任編輯：凌青根